158344. lajstromszámú szabadalom • Eljárás W847-antibiotikumok előállítására

158344 23 24 A lombik tartalmát 3 napig 37 C°-on forgó rázógépen inkubáljuk (280 fordulat/perc) (5 cm löket). B) Inokulum szakasz 25 ml oltóanyagot a csírázási szakaszból aszeptikusán átviszünk a fent csíráztatáshoz használt 500 ml steril közeget tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikba. A lombik tartalmát 3 napig 28 C°-on forgó rázógépen inkubáljuk. (280 fordulat/perc,, 5 cm löket.) C) Fermentációs szakasz Az inokulum szakaszból 25 ml alikvotot aszeptikusán átviszünk egy híg vizes nátronlúggal 7,8 pH-ra beállított' következő összetételű 500 ml steril táptalajt tartalmazó kétliteres Erlenmeyer-lombikba: Szacharóz Nátriumnitrát 3,0 3,0 Dikálium'hidrogénfoszfát 1,0 Magnéziumszulfát 0,5 Vas;(II)szulfát 'OiOl Pepton 8,0 Csapvíz 1000,0 ml A lombikok tartalmát forgó rázógépen 4 napig 28 C°-on inkubáljuk (280 fordulat/perc, 5 cm löket). A lombikok tartalmát egyesítjük, az egész fermentlének egy alikvot részét beállítjuk 9,5 pH-ra, és etilacetáttal (kb. 2 tf 1 tf fermentiere) extraháljuk. Az oldószeres fázist elkülönítjük, és vákuumban századrészére koncentráljuk. A koncentrátum aktivitását agarlemezes diffúziós módszerrel állapítjuk meg S. aureust (ATGC 6538P) használva összehasonlító mikroorganizmusként. A koncentrátum inhibíciós zónája kb. 20—35 mm. 2. példa: Félüzemi fermentáció A) Csírázási szakasz A csírázási szakaszt és az inokulum szakaszt az 1. példában leírt módon foganatosít juK. B) Fermentációs szakasz Aszeptikusán átviszünk i500 ml oltóanyagot az 1. példában leírt módon egy 10 liter steril táptalajt tartalmazó 14 literes fermentorba. A táptalajhoz 6 ml habzásgátlót i(Dow Corning B, gyártja Dow Corning Corporation, Midland, Michigan, Amerikai Egyesült Államok) adunk. A fermentációt 66 óra hosszat folytatjuk a következő körülmények között: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 állandó marad. Fermentáció közben a fermentációs keverék pH-ja 7,2 és 8,2 között marad. A sejttérfogat 3,5—4,5 ml állandó értéket ér el. A termelt antibiotikum aktivitása a teljes fermentlében 15—25 mm zónaátmérőnek felel meg lemezes próbában S. aureusszal vagy P. aeruginosával szemben. 3. példa: Félüzemi fermentáció A) Oltóanyagkészítés Az-1A) példában leírt 500—500 ml steril táptalajt tartalmazó négy 2 literes lombikhoz 0,5 ml térfogatú liofilezett Micromonospora sp. W847 kultúrát adunk. A lombikokat 280 fordulat/perc (5 cm löket) ütemben működő forgó rázógépre helyezzük, és 28 C°-on 72 óra hosszat inkubáljuk. B) Fermentációs szakasz Négy fermentor mindegyikébe a következő steril termelőközeget adjuk sterilizálás előtt 7,15—7,25 pH-ra beállítva: Triptikáz 170,0 g Nátriumklorid 50,0 g Dikáliumhidrogénfoszíát 25,0 g Glukóz 25,0 g Czapek—Dox táptalaj 350,0 g G. E.—60 habzásgátló (gyártja General Electric Company, Schenectady, New York) szükség szerint Csapvíz 10,0 liter Mindegyik fermentort beoltjuk 500 ml-rel a fentiek szerint készült 72 órás oltókultúrából. A fermentációs közeg hőmérsékletét 31 C°-ra növeljük, és 500 fordulat/perc ütemben keverjük; közben 0,5 liter levegőt bocsátva be percenként a táptalaj minden literére számítva. A keverést 24 óra elmúltával 600 fordulat/percre és 48 óra elmúltával 700 fordulat/percre növeljük. A fermentációt 69 óra elmúltával befejezzük. A négy fermentorból a fermentlevet (kb. 37 liter) extrahálásra egyesítjük. 2. A W847 antibiotikum-komplex extrakciója 4. példa: A W847 antibiotikum-komplex extrahálása laboratóriumi fermentációból (kromatográfiai úton) Hőmérséklet 31 C° Steril levegő betáplálás 4 liter/min. Keverés 250 fordulat/min Habzásgátló (Dow Corning B) szükség szerint Ennek az időszáknak a végén a termelt antibiotikum titere csúcsot ér el, és attól kezdve 60 65 A 2. példában leírt módon kapott 600 liter teljes fermentlé pH-ját híg nátronlúggal 9,5-re állítjuk be. A fermentlevet kétszeres térfogatú etilacetáttal extraháljuk. Az oldószeres fázist elkülönítjük, és vákuumban bepárolva olajos maradékot kapunk {kb. 30,0 g). Ennek az olajos maradéknak a biológiai aktivitása (1 : 20 hígítás) 12