158344. lajstromszámú szabadalom • Eljárás W847-antibiotikumok előállítására

25 158344 26 kb. 20—30 mm átmérőjű inhibíciós zónát ad S. aureusszal és kb. 15—25 mm átmérőjűt P. aeruginosával szemben. Az olajos maradékot oszlopkromatográfiai úton a következő eljárás szerint tisztítjuk meg: Az oszlopot 95%-os vizes etanolban szuszpendált 1000 g LH20 Sephadexszel (Pharmacia Fine Chemical, Inc.) töltjük meg. Az olajos maradékot felvisszük az oszlopra, és óránként 200 ml 95%-os etanollal eluáljuk. 50 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat antibakteriális aktivitásuk szerint (meghatározva agarlemezes próbában S. aureusszal, AT1CC 6538P, szemben) egyesítjük. A legnagyobb aktivitású frakciókat szárazra pároljuk. A szilárd maradékot kevés acetonban oldjuk, és az oldatot fölös térfogatú petroléterbe (fp. 30—<60 C°) öntjük. A keveréket szárazjég-aceton fürdőbe (kb. —50 C°) visszük, és 20 percig állni hagyjuk. Ezután a keveréket szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és az anyalúgot dekantálással elválasztjuk az olajos maradéktól. Az anyalúgot szárazra párolva tisztított W847 antibiotikum-komplexet kapunk. Az így termelt W847 antibiotikum-komplex titere a fent leírt hengeres csésze módszerrel meghatározva kb. 2,,25—2,75 jug/mg. 5. példa: A W847 antibiotikum-komplex extrahálása félüzemi fermentációból (oldószeres extrakció) A 3. példában leírt módon kapott egyesített íermentlevet {kb. 37 liter) 50%-os vizes nátronlúggal 9,5 pH-ra állítjuk be. Kétszeres térfogatú etilacetáttal extraháljuk, és a kivonatot 2150 ml-re bepároljuk. A W847 antibiotikumot-komplexet a következő eljárásokkal különítjük el: A) Sósavas extrakció Az etilacetátos koneentrátumból 500 ml-es alikvotot két ízben 250—250 ml 0,14 n (0,5%) sósavval extrahálunk. Az egyesített savas kivonatokat 5%-os vizes nátronlúg hozzáadásával kissé meglúgosítjük, 8,5—9,0 pH-ra, és 2 ízben 250—250 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos kivonatokat egyesítjük, és csökkentett nyomás alatt szárazra pároljuk. Az így kapott komplex titere kb. 525 p,gltng á fent ismertetett hengeres csésze módszerrel meghatározva. B) Kénsavas extrakció Az 5A) példában leírt módon járunk el a sósavat 0,(1 n kénsavval helyettesítve. Az így kapott komplex titere kb. 550 /tg/mg a hengeres csésze próbában. 3. A W847 antibiotikum-komplex szétválasztása és származékok készítése 6. példa: A W847 antibiotikum Q-frakció elkülönítése 2000 g analitikai minőségű kovasavból 105 cm magas és 7,6 cm belső átmérőjű oszlopot készítünk, kis szegmenseket szorosan egymásra helyezve. A 4. példa szerinti készült 13,0 g W847 antibiotikum-komplexet kovasavval kevert acetonban oldunk, és az acetont vákuumban elűzzük. A száraz keveréket felvisszük az oszlop tetejére. Az oszlopot kloroform és metanol 60 :40 térfogatarányú keverékével 100 ml/óra áramlási sebességgel eluáljuk. 200 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az oszlopot végigvizsgáljuk az egyes frakciókat S. aureus és E. colival szemben lemezes, módszerrel kipróbálva. Az aktív frakciókat vékonyréteges kovasavlemezeken kromatografáljuk másfél óra hosszat, ugyanazt az oldószerrendszert használva, mint az oszlophoz. Á frakciókat a fentebb leírt két módszer szerint meghatározott kromatográfiai jellegük szerint (lásd „A W847 antibiotikum-komplex jellemzése") egyesítjük. A frakciókat vákuumban koncentráljuk. Az alábbi 14. táblázatban jelzett módon egyesítve a frakciókat W847 antibiotikum C2 frakcióJhidrókloridöt különítünk el fehér porként az egyesített maradékokat 1 tf metanolban oldva és 10 tf etiléterrel kicsapva. Ennek az anyagnak a titere ekkor kb. 1000 /ig/mg a fent leírt hengeres csésze próba szerint. A W847 antibiotikum Ci-frákció elkülönítése Későbbi frakciókat egyesítve a 14. táblázatban jelzett módon W847 antibiotikum Ci frakciót kapunk fehér por alakjában a kiválasztott frakciók szárazra párolásával. Ebben az állapotban az anyag titere kb. 900 ftg/mg a fent leírt hengerpoharas próba szerint. A maradék aktív anyagot eluáljuk az oszlopról, egyesítjük, és maradékká koncentráljuk. 7. példa: A W847 antibiotikum A frakció és B frakció elkülönítése 500 g Florisilt 100 C°-on 16 óra hosszat aktiválunk, hexánnal rögzítjük, és szuszpenziókéní egy 105 cm magas, 3,8 cm belső átmérőjű, 700 ml tárolóképességű üvegoszlopba töltjük. Az oszlopra felviszünk 2,8 g-ot a 6. példa maradékából 10 ml metilénkloridban oldva. Az oszlopot egymás után 700 ml hexánnal, 700 ml éterrel, 700 ml etilacetáttal és növekvő mennyiségű acetont tartalmazó etilacetáttal eluáljuk (áramlási sebesség 200 ml/h). 100 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az oszlopot a fentebb leírt módon félmérjük a frakciókat S. aureusszal és E. colival szemben kipróbálva, majd vékonyréteges kromatografálást végezve. A frakciókat a 14. táblázatban jelzett módon egyesítjük. 10 15 20 25 30 35 40 45 OS 55 60 13