158238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalikus proteáz előállítására
158238 11 8. példa: A Bacillus subtilis varietas proteolyticus törzs sejtjeit az alábbi összetételű táptalajban tenyésztettük : 6000 ml össztérfogat 12 9. példa: A Bacillus subtilis varietas proteolyticus törzs sejtjeit az alábbi összetételű táptalajban tenyésztettük : 6000 ml össztérfogat: kukoricaliszt . 120 g szójaliszt 60 g CaCl2 sicc. 6 g KH2 P0 4 15 g szacharóz 30 g szilikon MSA 6 g ]0 kukoricaliszt 120 g szójaliszt 60 g CaCl2 sicc. 6 g KH2 P0 4 15 g szacharóz 30 g napraforgóolaj 6 g A tenyészlevet .a tenyésztés teljes időtartama alatt 1 : 1 volumen levegő/táp talaj térfogat mér• tékben levegőztettük és szellőztettük. A tenyészlé hőmérsékletét a tenyésztés során konstans értéken, 35 C°-on tartottuk. A pH a tenyésztés teljes időtartama alatt 6,9—7,3 érték között változott. 48 órás tenyésztés után a tenyészlé extracelluláris proteolitikus enzimaktivitása 40,0 mAE/ml volt. Ekkor a tenyészlé -levegőztetését megszűntettük, a tenyészlevet +16 C° értékre hűtöttük le, majd 21,4 g Na2 HP0 4 -t és 33,3 g CaCl2 -t adagoltunk a sejtes folyadékba, erőteljes kevertetés mellett. A pH-t 9,0-ra állítottuk 10%-os NaOH-Val, majd 1 órás kevertetés után a tenyészlevet 16 C°-on sejtmentesre szűrtük. Az éles szűrtlé térfogata: 5500 ml, proteolitikus enzimaktiivitása 43,7 mAE/ml volt. 22 g zselatint adtunk 40 C°-on. A szűrt levet filmibepárlióval 100 Hgimm nyomáson, 55 C°-on 2000 ml-e pároltuk be. A bepárolt lé aktivitása 120 mAE/ml volt. Az oldatot +4 C°~ra hűtöttük le és 1200 g ammóniumszulfátot, az oldat állandó, erőteljes Ikevertetáse mellett adagoltunk a rendszerbe. Az oldat pH-ja spontán változott. 18 órán át +4 C°-on való állás után a képződött csapadékot váJkuuimnuccson kiszűrtük az aktuális légnyomáson és hőmérsékleten, A kapott csapadék . nedves súlya: 60 g volt. A nedves enzimíeihérjét 40 C°-on levegő átfúvassál megszárítottuk. A száraz termék súlya 42 g, 5,71 AE/g aktivitással. A 'kitermelés 100% volt .az eredeti tenyészlé aktivitására vonatkoztatva. A kapott enzimfehérje proteolitiikus tulajdonságait hemöglobinra gyakorolt oldó hatásán keresztül vizsgáltuk. Az enzimfehérje proteolitikus aktivitásának optimuma pH 9,0 értéken és 50 C°-on volt. Az aktivitás pH-tól való függéséneik szélső értélkei 5,0—11,5. pH 7,0 értéken 50 C°-on tartva enziimaktivitás-veszteség nem volt tapasztalható. pH 10,0 értéken 50 C°-on 30 percen át tartva az aktivitás nem csökkent. 60 C°-on 20 perc alatt, pH 8,2-n az enzimaktivitás 5% veszteséget szenvedett. A kapott enzimifehérje proteolitikus aktivitása nátriumperiborátban, valamint mosószerkomponensek jelenlétében az 1. és 2. táblázatokban bemutatott értékek szerint változott. 20 25 40 45 50 55 60 65 A tenyészlevet a tenyésztés teljes időtartama alatt 1 : 1 volumen levegő/táptalaj térfogat mértékben levegőztettük és szellőztettük. A tenyészlé hőmérsékletét a tenyésztés során konstans értéken, 33 C°~on tartottuk. A pH a tenyésztés teljes időtartama alatt 6,5—8,9 érték között változott. 48 órás tenyésztés után a tenyészlé extraeelluláris proteolitiikus enzimalktivitása 38,0 mAE/ml volt. Ekkor a tenyészlé levegőztetését megszűntettük, a tenyészlevet +16 C° értékre hűtöttük le, majd 21,4 g Na2 HP0 4 -t és 33,3 g CaCl2 -t adagoltunk a sejtes folyadékba, erőteljes kevertetés mellett. A pH-t 9,0-ra állítottuk 10%-os NaOH-val, majd 1 órás kevertetés után a tenyészlevet sejtmentesre szűrtük. Az éles szűrtlé térfogata: 5600 ml. A szűrt levet 40 C°-ra melegítettük és 22,4 g zselatint oldottunk fel benne, kevertetés közben. Az oldat proteolitiikus enzimaktivitása 38,0 mAE/ml volt. A szűrt levet fiimbepárlóval 100—150 Hgmni nyomáson, 55—60 C°-on 2000 ml-re pároltuk be. A bepároit lé aktivitása 117 mAE/ml volt. Az oldatot 0 C°-ra hűtöttük le és 6000 ml 15 C°-os alkohollal (etanol vagy izopropanol) kicsaptuk az enzimfehérjét. 18 órán át +4 C°-on való állás után a képződött csapadékot vákuumnuccson kiszűrtük, az aktuális légnyomáson és hőmérsékleten. A kapott csapadék nedves súlya 70 g volt. A nedves enzimfehérjét 40 C°-on levegőátfúvatással megszárítottuk. A száraz termék súlya 49,0 g volt, 4,15 AE/g aktivitással. A kitermelés 95,5% volt az eredeti tenyészlé aktivitására vonatkoztatva. A kapott enzimfehérje proteolitikus tulajdonságait hemöglobinra gyakorolt oldó hatásán keresztül' vizsgáltuk. Az enziimf ehérje proteolitikus aktivitásának optimuma pH 9,0 értéken és 50 C°-on volt. Az aktivitás pH-tól való függésének szélső értékei 5,0—11,0. pH 7,0 értéken 30 percen át 50 C°-on tartva enzimaktivitás-veszteség nem volt tapasztalható. pH 10,0 értéken 50 C°-on 30 percen át tartva a proteolitikus emzimaktivitás veszteséget nem szenvedett. 60 C°-on 20 perc alatt, 8,2 pH értéken enzimáktivitás-veszteség nem volt megfigyelhető. A kapott enzimfehérje proteolitikus aktivitása nátriumperfoorátban, valamint moisószerkomponensek jelenlétében az 1. ós 2. táblázatokban bemutatott értékek szerint változott. 6
