158238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalikus proteáz előállítására
13 158238 14 10. példa:. A Bacillus subtilis varietas proteolyticus törzs sejtjeit az alábbi összetételű táptalajban tenyésztettük: ' 5 6000 ml össztérfogat: kukoricaliszt 120 g szójaliszt 60 g CaCl2 sicc. 6 g KH2 P0 4 15 g szacharóz 30 g napraforgóolaj 6 g Á tenyészlevet a tenyésztés teljes időtartama alatt 1 :1 volumen levegő/táptalaj térfogat mértékben levegőztettük és szellőztettük. A tenyészlé hőmérsékletét a tenyésztés során konstans értéken, 40 C° értéken tartottuk. A pH a te- 20 nyésztés teljes időtartama alatt 6,9—7,5 között változott. 48 órás tenyésztés után a tenyészlé extraoelluláris proteolitikus enzimaktivitása 37,0 mAE/ml volt. Ekkor a tenyészlé levegőztetését megszűntettük, a tenyészlevet +16 C° értékre 25 hűtöttük le, majd 21,4 g Na2 HP0 4 -t és 33,3 g CaCl2 -t adagoltunk a sejtes folyadékba, erőteljes kevertetés mellett. A pH-t 7,0-ra állítottuk, majd 1 órás kevertetés után a tenyészlevet 16 C°-on sejtmentesre szűrtük. Az éles szűrtié 30 térfogata: 5500 ml, proteolitikus enzimaktivitása 40,4 mAE/ml volt. A tenyószlőbez +5 C°-on 13,2 g tannint és 27,5 g CaCl2 -t adagoltunk. A keletkezett tannin-fehérje-komplexet kiszűrtük. A csapadékot 270 ml 0,1 M. pH 8,2-es fősz- 35 fátpufferrel 1 órán át rázattuk, majd a szuszpenziót szűrtük. A tiszta oldathoz 520 ml hideg acetont adagoltunk állandó hűtés közben. A csapadékot kicentrifugáztuk és vákuumban megszárítottuk 30 C°-on, 150 Hgmm nyomáson. 40 A száraz termiek súlya: 50 g volt, 2,46 AE'g aktivitással. A kitermelés 55,5% volt az eredeti tenyészlé aktivitására vonatkoztatva. 45 A kapott enzimfehérje proteolitikus tulajdonságait hemoglobinra gyakorolt oldó hatásán keresztül Vizsgáltuk. Az enzimfehérje proteolitikus aktivitásának optimuma pH 9,0 értéken 50 és 50 C°-on volt. Az aktivitás pH-tól való függésének szélső értékei 6,0—10,0. pH 7,0 értéken 30 percen át 50 C°-on tartva enzknaktivitás-veszteség nem volt tapasztalható. pH 10,0 értéken 50 C°-on 30 percen át tartva a proteo- 55 A kiadásért ielel: a Közgazdasági 7107426. Zrínyi (T) Nyomda, Budapi litikus enziimaktivitás 30% veszteséget szenvedett. A kapott enzimfehérje proteolitikus aktivitása nátriumperborátban, valamint mosószerkomponensék jelenlétében az 1. és 2. táblázatokban bemutatott értékek szerint változott. Szabadalmi igénypontok: •1. Eljárás alkalikus pro teáz előállítására azzal jellemezve, hogy az enzimfehérjét az OKI-ban 54/1969. szám alatt deponált Bacillus subtilis varietas proteolyticus sejtjeinek alámerített, levegőztetett kultúrában, komplex táptalajalkatrészek, szénforrások és ionos aktivátorok jelenlétében az enzimfahérje hőtűrő tulajdonságát fokozó hőmérsékleti körülmények között bioszintetizáljuk és a sejten kívül található enzimfehérjét a pH- és hőstabilitást fokozó védőanyagok jelenlétében izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja azzal jellemezve, hogy a táptalajba szénforrásként 0,5% szacharózt, vagy glükózt adunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a táptalajba ionos enzimaktivátorként Ca++ és Cl"" ionokat adagolunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a tenyésztési hőmérsékletet 28 C°—40 C° között tartjuk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a proteolitikus hatású enzimfehérjét a tenyészléhez adagolt 60%-nyi ammóniumszulfáttal csapjuk ki, kazein, zselatin vagy katfboximetilcellulóz védőanyagok jelenlétében, vagy pedig az enzimfeshérje kicsapására tannint és kalciumkloridot együttesen. adagolunk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a szűrt tenyészlé térfogatát 60 C°-on 150 Hgmm vákuumban, . kazein vagy zselatin vagy karboximetilcellulóz védőanyag jelenlétében az eredeti érték 1/10-^ére csökkentjük és a proteolitikus enzimfehérje kicsapását ezen koncentrált oldatból 34% etilalkoholnak, vagy 60%-nyi ammóniumszulfátnak az oldathoz történő adagolásával hajtjuk végre. 1 és Jogi Könyvkiadó igazgatója. it V., Balassi Bálint utca 21—23. 7
