158238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalikus proteáz előállítására
9 6000 ml össztérfogat: kukoricaliszt 120 g szójaliszt 60 g CaCl) sicc. 6 g KH2 P0 4 15 g szacharóz 60 g napraforgóolaj 6 g A tenyószilevet a tenyésztés teljes időtartama állatit 1 : 1 volumen levegő/táptal'ajtérfogat mérteikben levegőztettük és szellőztettük. A tenyészlé hőmérsékletét a tenyésztés során konstans értéken, 33 C°-on -tartottuk. A pH a tenyésztés teljes időtartama alatt 6,8—7,2 érték között változott. 65 órás tenyésztés után a tenyészlé extrtaedlluláris enzima'ktivi'tása : 10,0 mAE/ml volt. Ekkor a tenyészlé levegőztetését megszüntettük, a tenyészlevet +16 C°-ra lehűtöttük, majd 21,4 g Na2 PH0 4 -t és 33,3 g CaOlHt adagoltunk a sejtes folyadékba, erőteljes kevertetés mellett. 1 órás kevertetés után a tenyészlevat 16 C°-on pH 7,0-n sejtmenjtesre szűrtük. Az éles szűrtlé térfogata: 5600 ml, proteolitikus enzniialktiviitása 10,7 imAE/ml volt. Az oldathoz 22,8 g zselatint, adtunk. A tenyészlevet +4 C°-ra hűtöttük és" 336:0 g ammóniumszulifátot, az oldat állandó, erőtelljes kevertetése mellett az oldatba adagoltunk. Az oldat pH-jia spontán változott. 18 órán át +4 C°-on való állás után a képződött csapadékoit válkuumnuceson kiszűrtük az aktuális légnyomáson és hőmérsékleten. A kapott csapadék nedves súlya 45 g volt. A nedves enzimfehérjét 40 C°-on levegőbefúvássall -megszárítottuk. A száraz termék súlya: 31,5 g. volt, 0,953 AE/g aktivitással. A kitermelés 50i% vodt az eredeti tenyészlé aktivitására vonatkoztatva. A kapott enzimfehérje proteolitikus tulajdonságait hemoglobinná gyakorolt Oldó hatásán keresztül vizsgáltuk. Az enziimfehérje proteolitikus aktivitásának optimuma pH 9,0 értéken éis 50 C°-on volt. Az akti vitás pHntól való függésének szélső értékei: 5,0—11,0. pH 7,0 értéken 30 percen át 50 C°-on tartva enzimáktivitás-vesziteség neim volt tapasztalható. pH 10,0 értéiken 50 C°-on 30 percen át tartva a proteolitikus enzimaktivitás 10% vesztséget szenvedett. 60 C°-on 20 perc alatt 10% aktivitásveszteség volt tapasztalható. A 6. példa táptalajösszetételénél a szacharóz koncentrációja 1%. A proteoliitikus enzímaktivdáts 40%-kall icsökken az 5. példában leírtihoz képest. Amint azt jelen példánál részletesebb kísérletekkel igazoltuk, a szacharóz (és glükóz) a táptalajban max. 0,5%-íban laüfcalmiazbató, mert mennyiségének ezen érték fölé emelése a proteolitikus enzimek bioszintézisének fcatabolíitifcus represszióját idézi idő. A kapott enzáimfdhérje prolteolitilkus aktivitása nátmurnperborátban, valamint mosószerkomponensek jelenlétiében az 1. és 2. Táblázatokban bemutatott értékeik szerint változott. 10 7. példa: A Bacillus subtilis varietas proteolyticus törzs sejtjeit az alábbi összetételű táptalajban te-5 ny észtettük: 6000 ml össztérfogat kukoricaliszt 120 g szójaliszt 60 g CaCl2 sicc. 6 g KH2 P0 4 . 15 g glükóz 30 g pálmaolaj 6 g A tenyészlevet a tenyésztés teljes időtartama alatt 1 :1 volumen levegő/táptallaj-térfogat mértékben levegőztettük 'és szellőztettük. A tenyészlé hőmérsékletét a tenyésztés során konstans 20 értéken, 33 C-on tartottuk. A pH a tenyésztés teljes időtartama-*alatt 6,8—7,2 érték között változott. 48 órás tenyésztés után a tenyészlé extracelluláris proteolitikus enzim aktivitása 42,0 mAE/ml volt. Ekkor a tenyészlé levegőztetését 25 megszűntettük, a tenyészlevet +16 C° értékre hűtöttük le,, majd 21,4 g Na2 HP0 4 -t és 33,3 g CaCl2 -t adagoltunk a sejtes folyadékba, erőteljes kevertetés 'mellett. 1 órás kevertetés után a tenyészlevet 16 C°-on, pH 7,0-án sejtmentésre 30 szűrtük. Az éles szűrtlé térfogata: 5400 mi, proteolitikus enzimiaktivitása 46,7 mAE/ml volt. Az" oldathoz erős kevertetés mellett 20 g karfooximetilceilulóz nátrium-sóját adagoltuk. A tenyészlevet +4 C°-ra hűtöttük le és 3240 g 35 ammóniumszulfátot, az oldat állandó, erőteljes kevertetése mellett az oldatba adagoltunk. Az oldat pH-ja spontán változott. A 18 órán át +4 C°-on való állás után képződött csapadékot vákuumnuccson kiszűrtük, az aktuális légnyo-40 máson és hőmérsékleten. A kapott csapadék nedves súlya 57 g volt. A nedves enzimfehérjét 40 C°-on levegőátfúvatással megszárítottuk. A száraz termék súlya 40 g volt, 6,05 AE/g 45 aktivitással. A kitermelés 96,0% volt az eredeti tenyészlé aktivitására vonatkoztatva. 50 A kapott enzimfehérje proteolitikus tuliaj. donságaiit hemoglobinra gyakorolt oldó hatásán keresztül vizsgáltuk. Az enzimfehérje proteolitikus aktivitásának optimuma pH 9,0 értéken és 50 C°-on volt. Az aktivitás pH-tól való függé-55 sének szélső értékei: 5,0—11,0. pH 7,0 értéken 30 percen át 50 C%n tartva, enzimaktivitásveszteség nem volt tapasztalható. pH 10,0 értéken 50 C°^on 30 percen át tartva a proteolitikus enzimáktirvitás nem csökkent. 60 C°-on 30 perc 60 alatt 10% aktivitás veszteség lépett fel. A kapott enzimifeihiérje proteoliitikus aktivitása nátriumperíborátlban valamint mosószerkomponensek jelenlétében az 1. és 2. táblázatokban gá bemutatott értékek szerint változott. 5
