158238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalikus proteáz előállítására
3 158238 4 Amennyiben a tenyészlé cukorszintjét egy bizonyos érték alatt tartottuk, az enzimaktivitás fokozható volt, de egy optimális cukorszint felett az enzámszintézis visszaesése volt tapasztalható. Jelen szabadalmi bejelentésünk tárgya proteolitikus enzimfehérje előállítása egy Bacillus fajihoz tartozó törzzsel, melynek tenyésztési körülményeit úgy választjuk meg, ihogy a sejtek által termelt proteázi(ok) .aktivitása nagy legyen, pH-és hőoptimuma, valamint pH-és hőtűrése széles határok között mozogjon, ezen túlmenően az enzimfehérje tenyészléíből történő izolálási eljárásait úgy választottuk meg, hogy azok a lehető legjobb kitermelés mellett az enzim pH- és hőérzékenységét csökkentsék. Az általunk alkalmazott mikroorganizmus Bacillus subtilis varietas proteolyticus, melyet az Országos Közegészségügyi Intézetben 54/69 szám alatt deponáltunk. Az e törzs által termelt, alkalikus pH tartományban, proteolitikus hatást kifejteni képes enzimfehérje a többi ha.sonló enzimfehérjétől eltérő, előnyös tulajdonsága volt, hogy mosószerkomponensnék, de különösen nátriumpe.rborát jelenlétében változatlan enzimaktivitással volt képes működni. A törzs sejtjeinek optimális tenyésztési feltételeit, valamint a tenyésztés során képződött proteoMtilkus enzimfehérjéket a tenyészláből izoláló eljárásainkat az alábbi példákon szemléltetjük, melyek azonban nem tekinthetők korlátozó jellegűeknek. 1. példa: Bacillus subtilis varietas proteolyticus törzset az alábbi összetételű táptalajban tenyésztettük: 6000 ml össztérfogat: kukoricaliszt 120 g szójaliszt 60 g CaC03 30 g napraforgóolaj A tenyészlévet a tenyésztés teljes időtartama alatt 1 : 1 volumen levegő/táptalajtérfogat •-mértékben levegőztettük és szellőztettük. A tenyészlé hőmérsékletét a tenyésztés során konstans értéken, 28 C°-on tartottuk. A pH a tenyésztés teljes időtartama alatt 6,5—7,0 érték közben. változott. 90 órás tenyésztés után a tenyészlé extraoelluláris proteolitikus enzimakttivitása, Anson módszerével mérve ifAnson, M. O., J. Chem. Physiol, 22. 29 (1939)] m. Anson egység/ml volt. Ekkor a tenyészlé levegőztetését megszüntettük, a tenyészlevat +16 C° értékre hűtöttük le. majd 21,4 g (Na2HP0 4 -t >és 33,3 g CaiQ2 -t, adagoltunk a sejtes folyadékba, erőteljes fcevertetés mellett. 1 órás kevertet és után a tény észlevet 16 C°-on, pH = 7,0-n sejtmentesre szűrtük. Az éles szűrtlé térfogata: 5600 ml, proteolitikus enzimaktivitása 7,5 mAE/ml volt. A tenyészlévet +4 C°-ra hűtöttük le és 3360 g ammóniumszulíátot, az oldat állandó, erőteljies kevertetiése mellett az. oldatba adagoltunk. Az oldat pH-ja spontán változott. 18 órán át +4 C°-5 on való állás után a képződött csapadékot vákuumnuccson kiszűrtük, az aktuális légnyomásion, és hőmérsékleten. A kapott csapadék nedves súlya 29,2 g volt. A nedves enzimfehérjét 40 C°-on levegőtáfúvatással megszárítottuk. A j0 száraz termék súlya: 22,5 g volt, 1,4 AE/g aktivitással. A kitermelés 75% volt, az eredeti tenyészlé aktivitására vonatkoztatva. JK A kapott enzimfehérje proteolitikus tulajdonságait heimoglobinra gyakorolt oldó hatásán keresztül vizsgáltuk. Az enzimfehérje proteoliitikus aktivitásának optimuma pH 9,0 értéken és 50 C°-on volt. Az aktivitás pH-tói való füg-2Q gésánek szélső értékei 6,0—10,0 értékig terjedtek. pH = 7,0 értéken 30 percen át 50 C°-on tartva enzimaktivitás-veszteség nem volt tapasztalható. pH 10,0 értéken 50 C°-on 30 percen át tartva a proteolitikus enzimaktivitás 30 „ .%-os veszteséget szenvedett. A kapott enzimfehérje mosószerkornponensnek, valaimánt nátriumperfoorát jelenlétében észlelhető alkalikus proteáz aktivitását 40 0°-on, 60 percen át, il. letve 22 C°-on, 18 órán át az 1. és 2. Táblázat szemlélteti. 30 1. Táblázat Proteolitikus enzimaktivitás-változás mosószerkomponensek jelenlétében Maradék Koncéntrá- aktivitás az Mosószerkomponens dó eriedeü 40 %^áfoan zsíralikoholszuTfonát-Na 1 g/lit. 72,5% alkilbenzolszulfonsavas-N.a 0,5 g/lit. 93,2% foszfátok 2,5 g/lit. 103,0%: karboximetil cellulóz 0,15 g/lit. 1.10,0%: optikai fehérítő 0.02 K/lit. 90,5% színező anyag 0.0002 g/üt. 104,0% n átriumszulfát 2,5 g/lit. 1.15,0% Össze komponens együtt 107,0% 2. Táblázat Proteolitikus enzimaktivitás nátriumperborát jelenlétében Kon- Maradék aktivitás centráció 40 C°, 60' 22 C° 18 óra nátriumperborát 0,4 g/l enzimfehérje 0,2 g/l 100% 100% Na2 HPO/ ( 65 puffer pH 8,5 2
