158224. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított enzimek izolálására

158224 4 Az enzimeknek a mikrobiológiai fermentációs oldatokból vízzel elegyedő szerves oldószerekké], mint aeetonnal és alkohollal történő kicsapása is hátrányos némely szempontból. Elsősorban azért, mivel laz enzimeknek a tenyészetek szűrleteiből üzemi méretekben történő előállításához nagymennyiségű szerves oldószer szükséges, ami nagyméretű kicsapóedények használatát, valamint a megfelelő biztonsági berendezések előteremtését igényli. Bizonyos esetekben az enzimek szerves oldószerekkel történő kicsapása kizárólag előzetes, költséges koncentrálás után végezhető el. Az enzimeknek biológiai fermentációs oldatokból tanninnal végzett kicsapása számottevő térfogatnövekedéssel nem jár, kisózást nem kell végezni, a tannin könnyen hozzáférhető és nem túl költséges kicsapószer. Mégis ennek a módszernek is vannak bizonyos ihátrányiai. Így például tenyészetek szűrleteiből a nagy enzimtartalom ellenére sem lehet az enzimet egyedül tanninnal kicsapni, vagy csupán igen csekély mentékben. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely a fenti eljárások hátrányait kiküszöböli és az enzimeknek biológiai fermentációs oldatokból való izolálását üzemi méretekben, gazdaságosan lehetővé teszi. Kísérleteink célja mindenekelőtt az volt, hogy a mikrobiológiai tenyészetek szűrleteit tanninnal kezelve hidrolizáló enzimet csapjunk ki, illetve a kicsapást tökéletesítsük. Meglepő módon azt találtuk, hogy enzimtartalmú frakciók tanninnal való kicsapása megvalósítható vagy a kicsapás tökéletesíthető, ha a biológiai fermentációs oldatok vagy ezek szűrletei tanninnal kicsapható, elegendő mennyiségű fehérjét tartalmaznak. Mivel egyrészt a fermentációs oldatokban levő mikroorganizmusok teljes anyagcseréjükhöz fehérjót használnak fel, másrészt az enzimfehérje-konoentráció a kicsapáshoz rendszerint nem elegendő, a mikroorganizmusok anyagcseréjéhez szükséges fehérje mennyiségen felül oldható, kicsapható ífehérjét kell beadagolni, ihogy a tenyészetek szűrleteiben a tanninnal az enzimeket tökéletesen kicsapjuk. 10 15 20 25 30 35 40 45 Az oldható, tanninnal kicsapható fehérje beadagolt mennyiségétől függően sikerül az enzimkészítmények fajlagos aktivitását közel azonos hozamok mellett biztosítani. A gyógyászati készítményekhez vagy élelmiszerek feljavítására szolgáló enzimek előállításánál a következő termékeket célszerű beadagolni: kazein, tej, tejpor, savó, zselatin, oxizselatin, pepton és növényi fehérjék, mint pl. kukoricalekvár. Kiváltképpen az enzimek üzemi méretekben történő előállításához alkalmas a nagy mennyiségben rendelkezésre álló és viszonylag olcsó kukoricalekvár. A fehérjét célszerűen 0,5—10,0 g mennyiségben adjuk il liter fermentációs oldathoz. Ha tejet vagy savót használunk, úgy ezekből 50— 200 ml-t adunk 1 liter fermentációs oldathoz. Kukoricalékvárt előnyösen 10—100 ml/liter fermentációs oldat mennyiségben viszünk be, ha a kukoricalekvár átlagos nitrogéntartalma 3%- Ha a fehérjét a tenyészoldat szűrletéhez adjuk, úgy a fehérje hozzáadásának hatása az enzimnek ily módon először végrehajtott kicsapása, vagy a kicsapás tökéletesítése szempontjából különösen jelentőséggel bír. A tanninnal történő kicsapás előtt a miceliumtól mentesített, fehérjetartalmú, fermentációs oldatot szükség esetén savval vagy lúggal 5—6 pH-értékűre beállítjuk. Az így előkészített fermentációs oldathoz ezután tannin oldatot adunk, miközben nagy enzimtartalmú, oldhatatlan tannin-fehérje-komplex képződik, amely 2—24 óra állás után (ismert módszerekkel szétválasztható. A fermentációs oldatok szűrleteiből az enzim abban az esetben is kicsapható, ha a fehérjét a tanninoldat bevitele után adjuk a szűrlethez. 1 liter fermentációs oldathoz célszerűen 30 ml, 3—5 g tannint tartalmazó tanninoldatot adunk. A tannint a leválasztott csapadékból ismert módon, pl. aeetonnal végzett többszöri átkeveréssel távolíthatjjuk el. A tanninból elkülönített enzirnkoneentrátumot vákuumban szárítjuk. A találmány szerinti eljárás enzimképző aotinomyces-törzsek és penészgombák fermentációs oldatainak gazdaságos feldolgozását lehetővé teszi, amit az 1—3. táblázatok szemléltetnek. 1. táblázat Proteáz izolálása Aspergillus-tenyészetből A kísérlet száma Beadagolt fehérje A kicsapáshoz használt tannin Faji. aktivitás GE/mg Hozam CE/1 szűrlet % 89/1. — 4 g/l 0,773 170 9,7 89/11. 1% kukoricalekvár 4 g/l 0,736 1075 61,5 89/111. 2%, kukoricalekvár 4 g/l 0,489 1175 67,2 A fenti adatok azt igazolják, hogy az 1—2% kukoricalekvárt tartalmazó minta proteáz-akti-65 vitása a fehérjével nem elegyített minta aktivitásának mintegy 6—7-szerese. 2