158224. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított enzimek izolálására

5 158224 A kísérlet száma Beadagolt fehérje Faji. aktivitás DE/mg Hozam GE/1 szűrlet % 28/111. 28 10% kukoiücalekvar 0,205 nincs csapadék 1320 nincs csapadék 66 0 A penészgpimbákból előállítható proteolitikus eljárás az Actinornyces-tenyészetek szűrleteinek enzimek izolálása mellett a találmány szerinti 15 feldolgozására is vonatkozik. 3. táblázat Amiláz izolálása Aspergillus-tenyészetből A kísérlet száma Beadagolt fehérje Faji. aktivitás AE/mg Hozam AE/1 szűrlet % 71/1. 71/11. 13,15 2% kukoricalekvár 11,90 10 500 20 700 33,8 3,7 A fenti számadatok bizonyítják, hogy a tanninnal való kicsapást 2% kukoricalekvár jelenlétében végezve, az .amiláz aktivitása a fehérjével nem kevert minta aktivitás-értélkének kb. kétszerese. A találmány .szerinti eljárás a biológiai fermentációs oldatokból az enzimek tökéletes izolálását a tannines módszerrel gazdaságosan és egyetemlegesen lehetővé teszi oly módon, hogy . az anyagcseréhez már nem szükséges fehérjetöbbletet viszünk az oldatba. A kazeinegységekben (CE) kifejezett proteolitikus aktivitást Kunitz módosított eljárásával határoztuk meg [J. Ges. Physiol. 30, 291 (1947)]. Az amilázegységekben kifejezett amiláz^aktivitást (AE) pedig Street és Close módosított eljárásával mértük [Clin. Chkn. Acta 1, 256 (1956)]. A lipolitikus egységekben (LE) kifejezett lipolitikus aktivitást Tietz etc. módosított eljárásával határoztuk meg [Amar. J. Clin. Path. 31, 148 (1959)]. 1 LE az az enzimmennyiség, amely optimális kísérleti körülmények között a szulbsztrátból 1 /perc alatt 1 //. e.é.s. zsírsav képződését katalizálja. A találmány szerinti eljárás kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: Aspergillus oohraceus törzs fermentációs oldatának (2,2 CE/ml) 5 liter szűrletéhez keverés közben 100 ml kulkoricalekvárt elegyítünk. Az oldat pH-értékét 1 N nátriumhidroxid-oldattal 5,5-re beállítjuk. Ezt követően az enzim kicsapása céljából az oldathoz 150 ml vízben oldott 20 g tannint lassan enyhe keverés mellett hozzáadunk. Voluminózus csapadék válik le, amelyet 2 órán át szobahőmérsékleten állni hagyunk, a fölötte levő tiszta folyadékot leszívatjuk és a csapadékot centrifugáljuk (5000 30 g-nél). Az így kapott nedves csapadékot a tanrninnak a tannin-enzim-komplexből való kioldása céljából 3-szor 10 percig kb. 250—250 ml acetonnal keverjük. Az acetonos enzimkoncentrátumot vákuumban szobahőmérsékleten szárít-35 juk. 8,65 g szárazkészítményt kapunk, melynek fajlagos aktivitása 0,81 CE/mg, ami 1 liter fermentációs oldatra 1,400 CE hozamnak felel meg. A kitermelés 63,6%. 40 2. példa: Aspergillus ochraceus tenyészetnek 300 ml szűrlebét {1,6 CE/ml) 1 N sósavval 5,5 pH-értékre beállítjuk és 7,5 ml vízben oldott 600 mg 45 kazeinpeptonnal elegyítjük. A szűrlethez a proteáz kiesapása céljából enyhe keverés közben 9 ml, 1,2 g tannint tartalmazó oldatot adunk, ekkor a tannin^enzimkomiplex kiválik. A csapadékot centrifugáljuk (5000 g-nél) és a tannin 50 eltávolítása céljából acetonnal négyszer átkeverjük. Az így kapott terméket vákuumexszikkátorban szárítjuk. 520 g prateázt kapunk, melynek fajlagos aktivitása 0,58 CE/mg, ami 1.005 CE/liter hozamnak felel meg. A kiterme-5g lés 62,6%. 3. példa: Streptomyces lavendulae törzs tenyészetének 60 875 ml szűrletét (2,0 CE/ml) mechanikus keverés közben 87,5 ml kukoricalékvárral elegyítjük. A proteolitikus enzimet 28,5 ml, 3,8 g tannint tartalmazó oldattal kicsapjuk. Az elegyet először IV2 órán át szobahőmérsékleten, 65 majd ezt követően éjszakán át +4 C°-on tart-3