158004. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2'-amino-2'-dezoxi-kanamicin előállítására
5 158004 6 talajon tenyésztve képesek nagyobb mennyiségű 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin termelésére. Ezzel ellentétben azt tapasztaltuk, hogy néhány új, a természetes 0—4—1 Streptomyces kanamyceticus törzsből fejlesztett Streptoimyces kanamyceticus mutáns a szokásos táptalajon, a fent említett aminoglükózok és aminoglükóz-deoxistreptamin-származékok távollétében tenyésztve is nagy mennyiségű 2'-amino-2'-deoxi-kanaimicint termel. Ezen új, lényegében a 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin termelésére nagyobb mértékben képes mutánsokat úgy kaphatjuk, hogy a természetes Streptomyces kanamyceticus 0—4—1 törzset valamely mutagen szerrel, pl. nitrogénmustárral, vagy ultraibolya fénnyel kezeljük, és a túlélő imicéliumokiat vagy spórákat speciális szűrésnek vetjük alá. A fenti új, 2'-amino-2'-deoxi-kanaimicin termelésére képesebb mutánsok közé az A—4—6, 3AG, 18—8 és 19—2 laboratóriumi megjelöléssel ellátott változatok tartoznak. Az új mutánsokat az alaptörzstől az különbözteti meg, hogy a Streptomyces kanamyceticus 0—4—1 törzzsel szemben a xilózt csak kevéssé, vagy egyáltalán nem hasznosítják. A Streptomyces kanamyoeticus variánsainak vagy mutánsainak képzése várható eredmény, minthogy ez az Actinomyces faj általános tulajdonsága, így előre láthatóan bármely ismert Streptomyces kanamyoeticus törzs ismert mutagen szerrel, pl. nitrogénmustárral végrehajtott kezelése során a fent említett A—4—6, 3AG, 18—8 és 19—2 mutánsokon 'kívül számos egyéb, a 2'-amin'0-2'-deoxi-kanamicin termelésére képesebb változatok is kitenyészthetők. A jelen találmány más megvalósítási módja szerint 2'-amino-2'-deoxi-kanamicint nagyobb hozammal állíthatunk elő úgy, hogy valamely 2'-amiiio-2'-deoxi-kanamicin termelésére képesebb Streptomyces kanamyceticus mutáns aerob körülmények között ismert szén- és nitrogénforrásokat tartalmazó szokásos táptalajon addig tenyésztünk, míg jelentős mennyiségű 2'-ammo-2'-deoxi-Jkanamicin halmozódik fel a tenyészetben, majd az antibiotikumot a tenyészettől elválasztjuk. A fenti módon eljárva nagyobb hozammal állíthatunk elő 2'-amino-2'-deoxi-kanamicint oly módon, hogy a Streptomyces kanamyceticus törzs A—4—3, 3AG, 18—8 vagy 19—2 jelű mutánsát aerób körülményék között, szénhidrátot és nitrogéntartalmú tápanyagokat tartalmazó szokásos táptalajon addig tenyésztjük, míg jelentős mennyiségű 2'-amino-2'-deoxi-kanamycin halmozódik fel a tenyészetben, majd az antibiotikumot a tenyészettől elválasztjuk. A találmány szerinti eljárás mindkét foganatosítási módja szerint a tenyésztést általában az ismert Actinomyces fajok tenyésztésében szokásos módon végezzük. A táptalaj a 2'-amino-2'-deoxi-kana[mioi>n termelésére alkalmas Actinomyces fajok tenyésztése során alkalmazott ismert tápanyagforrásokat tartalmazza. így a táptalaj szénforrásként keményítőt, szukrózt, maltózt, glükózt, glicerint sttb., nitrogénforrásként szójabablisztet, oldható növényi fehérjéket, kukoricalékvárt, peptont, huskivonatot, nitrátokat vagy ammóniumsókat tartalmazhat. 5 A táptalajhoz ezen kívül egyéb megfelelő szervetlen sókat mint NaCl-ot vagy MgS04 -ot, továbbá szükség esetén a Streptomyces kanamyceticus növekedését elősegítő anyagokat is adhatunk. 10 A 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin előállítása céljából a tenyésztést szilárd közegen is végezhetjük, nagyobb mennyiségű /antibiotikum termelése esetén azonban a tenyésztést előnyösen folyékony közegben, áerób körülmények között 15 hajtjuk végre. Az antibiotikum nagyüzemi előállítására legcélszerűbben alulról levegőztetett szubmerz tenyésztést alkalmazunk, eljárhatunk azonban úgy is, hogy rázott tenyésztést, vagy folyékony közegben kevert levegőztetett te-20 nyésztést végzünk. A tenyésztés hőmérséklete 25 és 35 C° közötti érték, előnyösen azonban 28 C° vagy annak közelébe eső hőmérséklet lehet. Azt találtuk, hogy a tenyészetben felhalmozódó 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin mennyi-25 sége a tenyésztés kezdetétől számított 3—7 nap elteltével maximumot ér el. A tenyészetben felhalmozódott 2'-amino-2'~ -deoxi-kanamiicinít ismert módszerekkel, így pl. ioncserélő gyanták felhasználásával, szerves ol".0 dószeres extrakcióval, vagy az ismert vízoldható, báziikus antibiotikumok tisztításában alkalmazott kicsapószerekkel választhatjuk el a tenyészettől. A 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin ipari előállítása során előnyösen oly módon járunk 35 el, hogy az antibiotikumot ioncserélőn, célszerűen karbonsav-típusú kationcserélő gyantán adszorbeáljuk majd eluáljuk, vagy az elválasztást megfelelő hordozóanyagot, mint p-toluolszulfonsavat vagy laurilsavat tartalmazó szer-40 ves oldószeres extrakcióval végezzük. így pl. a 2%armno-2'-deoxi-7kanamicint a következőképpen izolálhatjuk: a 2, -amino-2'-deoxi-kanamicint tartalmazó fermentléből a szilárd anyagokat szűréssel micéliumlepény formájában eltá-45 volítjuk, a szűrletet Amiberlite IRC—50-el (Rohm et Haas Co. USA cég által előállított ioincseirélő gyanlta, védjegyikánt lajstromozott név) kezeljük, a terméket vizes ammóniával eluáljuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük és 5Q betöményíitjük, a betöményftett frakciókat Dowex 1 x 2-n (Dow Chemical Co. USA cég által előállított ioncserélő gyanta, védjegyezett név) kromatográfiás úton elválasztjuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük és betöményítjük. A „ betöményített frakciókat ismét kromatográfiás elválasztásnak vetjük alá, adszorbensként Amberlike CG—50-t alkalmazunk és víz^vizes ammónia eleggyel gradiens eluciót végzünk. Ily módon egyetlen, a hatóanyagot — azaz 2'-amino-2'-deoxi-kanamieint — tartalmazó frakciót kaphatunk. Ezt a frakciót liofilizáljuk, és a kapott ,. port víz—dimetiliformamid elegyből kristályosítva krigtályos 2'-amino-2'-deoxi-kanamicinhez jutunk. (55 A 2'-amino-2'-deoxi-kanamicin 183—188 C°-on 3
