158003. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás lizosztafin előállítására
3 158003 4 -'-értékre csökken 9 óra elteltével. Ekkor azután a pH meredek emelkedése kezdődik és 13 óra alatt eléri a 7,5 értéket. Más fermentációs folyamiatoknál ennél jóval magasabb végső pH-értéket lehetett sok esetben megfigyelni. Az 1. ábrán a szaggatott vonal a fermentáció folyamán mért lizosztiafin-kancentrációt adja meg a közeg il ml-jében mért antibiotikus aktivitás-egységekben kifejezve. Ezeket laz aktivitás-értékéket a 3 278 378 sz. (fentebb idézett) amerikai szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel határoztuk meg. E módszer fotometriás mérésen alapul és azt a lizosztafin-mennyiséget tekinti egységnek, amely egy olyan mintában van jelen, mely egy S. aureus FBA 209P sejteket meghatározott koncentrációban tartalmazó szuszpenzió turbiditásáit 10 perc alatt 50%-kal csökkenti, egy oly azonos 'koncentrációjú kontroll-szuszpenzióhoz viszonyítva, amelyet nem tettünk ki a vizsgálandó lizosztafin-minta hatásának. A lizosztafin-aktivitási próba értékskáláját a baloldali ordinátána vittük fel. A baloldali ordinátán egy oly skálát tüntettünk fel, amely a fermentációs közegben jelenlevő S. staphylölyticus kultúra sejtjeinek száraz súlyát is megadja mg-'ban, a fermentációs közeg 1 ml-jére számítva. Ez esetben a skála az 1. ábra harmadik, a háromszögekkel jelzett pontokat összekötő görbére vonatkozik és a száraz sejt-súly (DCW) időbeli változásait fejezi ki. A sejt-növekedés kb. 4 óra elteltével vesz fel 'mérhető értékeket. 6 óra elteltével a lizosztafin már kimutatható a fermentációs közegben. E két érték azután durván párhuzamosan növekszik kb. a 8. óráig, amikor az antibiotikum-termelés szintje állandósul kb. 6 egység/ml koncentrációinál, amint a pH-érbék 6,3 alá csökken. Az antibiotikum-termelés azután 10 óra elteltével, amikor a pH-érték emelkedni kezd, ismét emelkedik és 13 óm elteltével eléri a kb. 17 E/ml szintet. A sejtfejlődés 9 óra múlva egy maximális szintet látszik elérni, majd fokozatos visszaesés kezdődik. Az ilyen fermentáció folyamán az optimális pH-viszonyok aránylag rövid ideig állnak fenn. Gondoskodni lehet természetesen arról, hogy a pH-értéket la fermentáció folyamán sav vagy bázis 'hozzáadásával folytonosan a kívánt szintre állítsuk be, ez azonban ipari méretű termelés esetén lényegesen növeli az eljárási költségeket. A jelen találmány egyik célkitűzése az volt, hogy a fermentáció során oly lizosztafin-tartalmú fermentációs leveket nyerjünk, amelyek antibiotikum-titiere nagyobb az eddig elérhetőnél. A találmány további célkitűzése oly fermentációs eljárásnak a kidolgozása volt lizosztafin termelése céljaira, amelynek során kevésbé kell fermentáció közben a pH-értéket szabályozni, ami szintén lényegesen javítja az eljárás gazdaságosságát ipari méretű termelés esetén. A fentebb említett és az 1. ábrán ábrázolt fermentációs folyamat teljesíti a találmány fent említett első célkitűzését; a fermentáció e módja valóban a találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módiját képezi. Azt tapasztaltuk, hogy az antibiotikum-hozam váratlanul nagy-5 mértékű megnövekedése érhető el, ha enzimesen hidrolizált kazeint viszonylag nagy koncentrációban alkalmazunk nitrogént szolgáltató tápanyagként a fermentációs közegben. Az oly fermentációs közegekben, amelyek legalább 4 10 súly% enzimesein hidrolizált kazeint tartalmaznak nitrogént szolgáltató tápanyagként, tartósan rendkívül magas antibiotikum-titert eredményeznek az egyébként a 3 278 378 sz. amerikai szabadalma leírásban leírt módon lefolytatott 15 fermentáció során. Így ha az 1. ábrán szemléltetett fermentációs műveletet 4,8 súly% enzimesen hidrolizált kazeint tartalmazó tápközegben folytatjuk le, 17 egység/ml antibiotikum-titert érünk el, míg a 3 278 378 sz. amerikai 20 szabadalmi leírás 1. példája szerint, amely lényegileg e tápanyagnak a közegben alkalmazott koncentrációja tekintetéiben tér csupán el ettől az eljárásmódtól, csak 2,5 E/ml antibiotikum-hozamoít érték el. 25 A találmány második célkitűzését azáltal teljesíthetjük, hogy oly vizes tápközeget alkalmazunk, amely dextróz vagy más szokásos hasonló szénhidrát-jellegű tápanyag helyett asszimilál-3Q ható szénforrásként glicerint, mannózt vagy galaktózt tartalmaz. Azt a 'meglepő tényt ismertük fel, hogy az említett asszimilálható szénfoirrások valamelyikének alkalmazása esetén kiküszöbölődik a prlnérték szabályozásának szükségessége „5 a fermentáció folyamán és az antibiotikum-4iozam még további növekedését érjük el. A 2. ábrán az 1. ábrához hasonló típusú görbék csoportját látjuk, amelyek szemléltetik 1 súly% glicerin asszimilálható szénforrásként való al.. kaknazásának a pü^értékre gyakorolt kedvező hatosát. A fermentációt egyébként az 1. ábrában szemléltetettél azonos módon folytattuk le. Látható, hogy a kezdeti 7,3 pH-érték viszonylag állandó marad. kb. a fermentáció első 6 órája folyamán, majd pH = 7,75-ig emelkedik, azután ismét csökkenni kezd és 12 óra múlva a pH = 7,35 értéket éri el. A mikroorganizmus szaporodása kb. 4 óra (elteltével kezdődik lényeges mértékben, az antibiotikum-termelés pedig kb. 6 óra elteltével válik lényeges mértékűvé; azután mindkettő párhuzamosan növekszik tovább. A mikroorganizmus fejlődése és az antibiotikum-teirmelés azonban ebben az esetben egyaránt lényegesen nagyobb mértékű; a maximális antibiotiíkutm-konoentrációt ebben a kí-55 sérletben 12 óra élteltével értük el, kb. 35 egység/ml szinten. Ez a fermentáció tehát számot^ tevő .mértékben eltér a dextróz alkalmazásával lefolytatott fermentációtól abban a tekintetben, hogy a pH-érték viszonylag szűk határok között 60 és a kívánt előnyös tartományban marad, az antibiotikum pedig lényegesen nagyobb koncentrációban képződik a fermentációs közegiben. A találmány szerinti eljárásnak az 1. és 2. 65 ábrán szemléltetett két alapvető vonását némi-2
