157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására
9 157957 10 eredmény nem ezt az értéket (vagy ehhez nagyon közel álló adatot) szolgáltatja, úgy az enzimek aktivitása nem megfelelő. Ellenkező esetben az enzimek aktivitása kielégítő, s így a készítmény kapszuláikba tölthető. Kapszuláiéi 5 céljára a következő elegyet állítjuk elő: trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát puffer (a fenti módon előállított termék) 100—250 P magnéziumszulfát, kristályos (ekvivalens mennyiségű magnézium-glutamátot vagy -aszparaginátot is felhasználhatunk) 80—120 g TPN 12— 18 g ATP 10— 18 g liofilizált enzim-elegy 80—200 g A felsorolt száraz szilárd anyagokat elegyít^ jük, majd alkalmas berendezésben, pl. golyós malomban porítjuk. A kellő finomságra porított anyagokból gondos keveréssel homogén elegyet állítunk elő. Az így kapott reagenselegy a hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimet gumiarábikum-stabilizátorral, trisz-(hidroximetil)aminometán-szuIfát-pufferrel és ammóniumszulfát-pufferrel együtt tartalmazza, amelyek az enzimeknek kellő stabilitást biztosítanak hosszú ideig történő tárolás esetén is. A reagens-elegy továbbá trisz-(hidroximetil)aminamebán-szulkcinát-puf f érrel együtt ATP és TPN koenzimeket is tartalmaz, amelyek a vizsgálat elvégzése során a reakció lezajlását biztosítják. A kapott reagens-elegyet egy minta egyszeri meghatározására alkalmas mennyiségű adagokra oszthatjuk. Az adagok súlyának meghatározása céljából meghatározzuk az elegyben levő enzim aktivitását. Ezt a vizsgáltot az enzimtartalmú liofilizált porkeverékek aktivitásának meghatározásánál ismertetett módszerrel végezhetjük el. A reagens-elegy kis mintáit megfelelő menynyiségű vízben oldva folyékony reagenst állítunk elő. A reagenshez fent megadott standard A fenti reakciók során tehát a szérumban eredetileg jelenlevő glükóz glükóz-6-foszfáttá alakul, amely a TPN-t TPNH-vá alakítja. Minthogy a kapszulában levő reagenselegy fölös mennyiségű reagenseket tartalmaz, a reakciót kizárólag a szérumban jelenlevő glükózmennyisége határozza meg. így a reakciósorozat végén kénződő TPNH mennyisége az eredetileg jelen volt glükóz mennyiségétől függ. A reagáltatást a kísérleti idő végéig — illetőleg a glükóz teljes átalakulásáig és a reakglükóz oldatot (200, 400, ill. 600 mg% koncentrációjú glükóz-oldat) adjuk, és az optikai sűrűségben bekövetkezett változást mérjük. A vizsgálatok eredményeiből meghatározhatjuk a porkeverékben levő enzimek aktivitását. Ha az így kapott reagens-elegyet glükóz meghatározására használjuk fel, a reakciót a glükóz teljes átalakulásig hagyjuk folyni. A teljes átalakuláshoz szükséges időt az.enzimek aktivitása határozza meg. így az egyes kapszu- . Iákba töltendő reagens-elegy mennyiségének meghatározására először a reakció befejeződéséhez szükséges időt kell meghatároznunk, önkényesen kiválasztunk egy olyan időintervallumot (pl. 5 perc), amely alatt a reakciót végre kívánjuk hajtani. Ezután a kiválasztott időpont tört részét (pl. 3 perc) tekintjük, amely alatt a reakció valóban végbemegy. Ezzel az intézkedéssel biztosítjuk, hogy a reakció a kísérlet ideje (jelen esetben ez 5 perc) alatt valóban végetár. Ezután meghatározzuk az' egy. kapszulába bemérendő reagenselegy mennyiségét. Az így meghatározott mennyiségű reagens-elegygyel végezve a méréseket biztosak lehetünk afelől, hogy a reakció a kísérleti idő letelte előtt minden esetben végetér. A reagenseket célszerűen standard méretű kapszulákba töltjük. Előfordulhat, hogy a kapszula mérete a legnagyobb betöltendő anyagmennyiségnél is nagyobb. Ebben az esetben a reagens-elegyhez olyan mennyiségű töltőanyagot, pl. mannitot adhatunk, amely éppen teljesen kitölti a kapszulát. A glükóztartalmú szérum meghatározását egy kapszula fenti reagenselegy segítségével pl. a következőképpen végezhetjük. A meghatározáshoz megfelelő mennyiségű glükóztartalmú szérumminta optikai sűrűségét 340 m^-nál meghatározzuk. Ezután egy kapszulába töltött száraz reagenselegyet megfelelő mennyiségű vízben feloldva folyékony reagenselegyet állítunk elő. A folyékony reagenst a szérummal elegyítjük. Ekkor a következő reakciók mennek végbe: ció lezajlásáig — végezzük, s ezután ismét meghatározzuk a minta optikai sűrűségét 340 m( tt-nál. Tekintettel arra, hogy a képződött TPNH ebben a hullámhossz-tartományban abszorbeál, a reakció előtt és a reakció után mért optikai sűrűség különbsége a képződött TPNH, mennyiségére jellemző. Figyelembe véve, hogy a képződött TPNH mennyisége kizárólag az eredetileg jelen volt glükóz mennyiségétől függ, az optikai sűrűségkülönbség alapján meghatározhatjuk a szérum glükóztartalmát. 10 15 }-{] 25 50 35 40 45 ÍZ lel 55 6Ü 65 ,...,, „ mT ,hexokináz , , , ' , glukóz + ATP : • glükóz-6-P + ADP ,...,, „ T-, , „-„,-, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz „ , , , „,TM,TT glufeoz-S-P + TPN .—-—°— • 6-foszf orglükonát + TPNH 5
