157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

7 157957 Ő A találmány szerinti stabilizált reagens-elegyeket és azok előállítását az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa: Szérumban jelenlevő glükóz meghatározására io az alábi komponensekből álló reagens-elegyet állítjuk elő: Enzim: hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 15 Puffer: trisz-(hidroximetil)-aminometán-szukcinát Stabilizálószer: gumiarábikum-trísz-(hidroxi~ metil)-aminometán szulfát és ammóniumszulfát 20 Szubsztrátum: nincs Gyorsító: inzulin és magnéziumszulfát Koenzimek: adenozin-trifoszfát és trifoszfopiridin-nukleotid Töltőanyag: mannit 25 Nagymennyiségű kapszulás készítmény, vagy egyes meghatározásokhoz elegendő mennyiségű reagens előállításra az alább közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagens- «n elegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva kapszulákba tölthetünk. A példában megadott mennyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkoznak. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra gg szolgálnak, s azok a követelményeknek megfelelően változtathatók. Az eljárás első lépésében megfelelő pufferoldatot állítunk elő, a következő komponensek 4

Q elegyítésével: gumiarábikum 50—100 g trisz-(hidroximétil)-aminometán--szulfátpuffer, 0,2 M, pH: 7,4—7,6 75—150 ml ammóniumszulfát, ÍM, pH: 7,5 (ammóniával beállítva) 75—150 ml inzulin 50—750 mg hexokináz 100 mg glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 100 mg Először a puffert állítjuk elő oly módon, hogy trisz-(hidroximetil)-aminometán-oldatot állítunk elő, és annyi kénsavat adunk hozzá, hogy 0,2 mólos, 7,4—7,6 pH-jú oldatot kapjunk. A trisz-(hidroximetil)-aminometán-szulfát-oldathoz ezután a fent megadott mennyiségű gumiarábikumot, ammóniumszulfátot és inzulint adjuk, és a kapott homogén oldatból vákuumkezeléssel eltávolítjuk a levegőt. Az oldatba ezután a fent megadott mennyiségű hexokinázt és glükóz-í6-foszfát-dehidrogenázt mérjük be, a kapott homogén oldatot fagyasztjuk, és a teljes vízmennyiséget vákuumban eltávolítjuk. Az ismertetett eljárással száraz vagy liofilizált homogén port kapunk, amely az enzimeket tartalmazza. A szárítás után meghatározzuk a liofilizált porkeverékben levő hexokináz és glükóz-6--foszfát-dehidrogenáz enzimek aktivitását. A meghatározáshoz az alábbi anyagokat használjuk fel: trisz-Hiidroxirnetil)-aminometán-szukcinát-pufferoldat (1,7 g/100 ml) ,1 ml magnéziumszulfát, 0,1 mólos oldatban 0,4 ml trifoszfopiridin-nukleotid, 10 mg/2 ml víz 0,2 ml adenozin-trifoszfát, 9 mg/2 ml víz 0.2 ml liofilizált enzimek 10 mg víz 1,2 ml trisz-(hidroximetii)-aminometán 100—200 g borostyánkősav 30— 70 g 45 Az anyagokat összekeverjük, majd ismert módon, pl. .8 órán át golyósmalomban kezelve, finom porrá alakítjuk. A kapott elegy kis mintáját ezután vízben oldjuk, és az oldat pH-ját megmérjük. A pH csökkentésére borostyánkő- 50 , savat, a pH növelésére pedig trisz-(hidroximetil)-aminometánt adhatunk az elegyhez. Az elegy pH-jának 7,4—7,6-os tartományban kell esnie. Nyilvánvaló, hogy a komponensek pontos arányát az elegy pH-ja dönti el. A megfe- 55 lelően porított, és az előre meghatározott pH-tartományt biztosító pufferelegyet foszforpentoxid jelenlétében vákuumban kb. 50 C°-on 24 órán át, illetve a teljes nedvesség eltávolításáig szárítjuk. 60 Ezután a hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimet-tartalmazó száraz liofilizált porkeveréket állítjuk elő az alábbi komponensek elegyítésével: ,65 Először a trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát-pufferoldatot állítjuk elő oly módon, hogy 1,7 g, a példa első lépésében közölt módon készített puffert 100 ml vízben oldunk. \A fent felsorolt többi komponenst a pufferoldathoz adva homogén elegyet állítunk elő. A kapott oldat optikai sűrűségét 340 rn<t-nál meghatározzuk. Ezután az oldathoz előre meghatározott mennyiségű, ismert koncentrációjú glükózolditot adunk. A glükóz hozzáadására végbemenő reakció során a TPN TPNH-vá alakul. MinthocTv' a rendszerben bőséges mennyiségben áll a TPN rendelkezésre, a reakció mértékét kizárólag a glükóz mennyisége határozza • meg. A reakció lezajlása után ismét megmérjük az oldat optikai sűrűségét 340 m,«,-nál. A fenti kísérletiben célszerűen különféle standard glükózoldatokat, pl. 200, 400 és 600 mg% koncentrációjú glükózoldatokat alkalmazunk. A reakció előtt és a reakció után mért optikai sűrűség különbségének 0,230^szorosa a standard glükózoldat mg%-ban kifejezett koncent rációjának századrészével azonos. Ha a mérési