157648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inaktivátor dúsítására

5 157648 6 jellegű pufferoldatoklkal az alábbi előiratok szerint végezhető: A vízoldhatatlan tripszin-származák előállí-. tása: A vízoldhaltatlan tripszin-szárimazékot Katzhalski et al. [Biochemistry 3, 1905 (1964)] javasolt előírásai szerint az alábbi módon készítjük: 5 g tripszint 7.5 pH-értékű 500 ml 0,2 mólos káliumfaszfát-pufferiben feloldunk, majd 1 g maleinsavanhidrid-atilénkopoliimert (DX 840— 2:1, EMA+M) 1 liter fenti puff er oldatban szuszpendálunk és ehhez 100 ml 0,1%-os hexametiléndiamin vizes oldatát adjuk. A reakció lezajlása után a kapott terméket kétszeres térfogatú leülepedett ceHulózparral elkeverjük és oszlopot képezünk belőle. Az oszlopot 0,1 mól nátriumkkwiddt és 0,01 mól kalciumkloridot tartalmazó 7,8 pH-értékű 0,1 mólos trietanolamin-pufferrel mindaddig mossuk, míg az eluátumíban aktív tripszin már nem mutatható ki. A felsorolt műveleteket hűtés közben (4 C°) végezzük. A tripszin-inibiibitor tisztítása: A szövethomogenizátumot parklórsavval vagy etianollal febéirjsmentesíitjük, vákuumban koncentráljuk és a fenti pufferoidattal 7,8 pH-értókre beállítjuk Az elegyet közvetlenül a fenti oszlopra adagoljuk. Az oszlop kb. 1 g tripszin gátlására elegendő mennyiségű inhibitoMnenynyiséget képes adszorbeálni. Az oszlopot az inhibitor-oldattal való kezelés után pufferrel és vízzel proteinmentesre mossuk. Végül az inhibitort HCl/KCl pufferrel (0,2 KCl) 2 pH-értéken az oszlopról isméit eluáljuk. Ezután az oszlop 7,8 pH-értékre történő ismételt beállítás után a következő tisztítási műveletben ismét felhasználható. Az oszlop — amennyiben hűtés mellett dolgozunk (vízzel való hűtés 4 C°-ra) —: hónapokig észrevehető kapacitáscsökkenés nélkül alkalmazható itripszin-dnhibitorok izolálására. A fenti módon sertéspantoreászból izolált inhibitor a kísérő proteinekből teljesen mentesnek tekinthető (specifikus aktivitása 2,8 TmU//ig protein). Ha a tisztítást 4—8 C° között Végezzük, akkor a hozam klb. 80%. Bepárlésután a savas jellegű inhibitor-oldatot sómentesítjük (Sephadex G—25) és liofilizáljuk. A találmány szerinti eljárással elért, tiszta, de még sótartalmú inhibitorra számított hozamokat feltüntetjük a táblázatban. Az EM-tripszönoszlopok hosszabb időn keresztül felhasználhatók inhibitorok izolálására. Az előbbieknél analóg módon végeztük az 1.2. és 1.3. reakciókat is (1. táblázat). A táblázatiban szereplő 1.2, eljárásváltozat mind a felhasznált munkamódszer (a), mind a felhasznált gyanta (b, illetve c) tekintetében a fentiekhez képest az alábbiak szerint módosítható : a) 500 mg maleinsavanhidrid-elilén-kopolimerizátumból és 250 mg tripszinből (183 U) az 1.2. szerint tripszin-gyanta-komplexet állítunk elő és azt lecentrifugáljuk. A tripszin-gyaníta 5 maradékát centrifugán 7,0 pH-értékű 0,5 mólos foszfátpufferrel és 0,1 mólos nátriumik'lorid oldattal ötször-ötször mossuk. A mosóvíz végül semmiféle tripszin-aktivitást nem mutat. A kimosott maradék tripszin-aktivitás a 10 U. 10 Eszerint a bevitt tripszin kb. 95%-a a gyantán megkötődött. A gyantát ezt követően jéggel történő hűtés közben 7,0 pH-értéiken 2,12 mi sertéspankre-15 ászból kinyert, nyers fehérjemen'tesíitett inhibitor-oldattal reagáltatjuk, mimellett az inhibitor-oldat 18,7 aktivitású volt (specifikus aktivitása Waddeli szerint 55 mU/mg fehérje). 5 perces keverés után a gyantát lecentrifugáljuk 20 és a centrifugában ötször mossuík 0,1 mólos nátriumklorid-oldatt'al. A kimosott egyesített maradékot tripszingátiást már nem mutatnak. A maradékot jég-25 fürdőben 100 ml 0,1 mólos nátriumklorid-oldatban szuszpendáljuk és 50 ml 0,1 n-sósavval 2,0 pH-értékre beállítjuk. Az elegyet centrifugáljuk, a maradékot pedig mégegyszer 150 ml 0,1 mólos nátriumfclorid/0,1 N-sósav-oldattal a 30 centrifugán 2,0 pH-értékre mossuk. Az egyesített maradékok gátló hatása 11,9 U értékű volt, amely megfelel a bevitt gátlóanyag 61 %-ániak. A specifikus gáitlóhátás Waddell szerint 900 mU/mg protein. A dúsítás mértéke 35 tehát tizenhaitszarosra tehető. A gyanta továbbra is felhasználható állapotban marad. b) 0,4 g 53% vinilpirrolidont tartalmazó maleinsavanhidräd-vinilpirrolidon-k'Qpoliimeirizatu-40 mot 1.2. szerint 2,0 g tripszinnel (1168 U) reagáltatunk, majd cellulózporral együtt oszlopba töltjük. Az oszlopot sertéspankreászból előállított 163 U aktivitású nyers inhibitor-oldattal terheljük, mossuk, majd 0,1 mólos sósav és 0,1 45 mólos wátmumíklorid oldattal eluáljuík. Az inhibitor4iozam 99 U, vagyis a bevitt mennyiség 61%^a nyerhető ki. c) Manetíke szerint [Maoroniolecular Chemie, 50 39, 13 (I960)] előállított metafcrilsavból és metakrilsav^3-fluoranilidból álló kopalimerizátumot 0,1 mólos hidrogédkarfoonátos puff erben szuszpendálva 4 C°-on tripszitnnel viszünk reakcióba. A kapott gyantát cellulózporral elkeverjük, . oszlopba töltjük és 4 C°-on 7,8 pH-éritékű 0,1 mólos trisz-pufferrel kimossuk, míg az eluátumtoan tripszin már nem mutatható ki. Az. oszlopot ezután 7,8 pH^étftéken sertéspankreász-inhibitor nem tisztított oldatával terheljük, míg az eluátumban inhibitor már nem mutatható ki. Az oszlopon megkötődött inhibitort ezután 0,1 mól sósav 0,1 mólos nátriumiklorido» oldatával eluáljuk. 2. EM-kimotripszin: 200 mg EMAnt 200 ml 65 pufferben 0 C°-on rövid idő alatt homogem-S