157648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inaktivátor dúsítására
7 157648 8 zálunk, majd 20 ml 0,1%-os hexametiléndianiin oldattal 3 percig keverjük. Ezután 100 ml 7,5 pH-értékű, 0,2 mólos foszf átpuffer-oldatban feloldott 1 g a4dmotripszint adunk hozzá és a keveréket éjjelen keresztül 0—4 C° hőmérsékleten keverjük, miméllett az oldat pH-értékét puffer esetleges hozzáadásával 7,5 értékea tartjuk. A csapadékot többízlben. 7,8 pH-értékű trietanolamin^pufferoHattial (0,1 mól trietanolamin. 0,1 mól nátriumfclorid és 0,01 mól kaloiumklorid) mossuk (oentaifugálással), majd kb. háromszoros térfogatmennyiségű cellulózporral (Schleicher-Sdhüll) elkeverjük és vízzel hűtött oszlopra öntjük. Az oszlopot még kb. 6 óra hossziat az előbbi pufferoldattal mossuk. A kimotripszin^inihibitarok adszorpciója: 2.1.) A fenti 7,8 pH-értékű pufferoldaitban feloldott 50 000 KIE kallikrein-inaJktivátorí az oszlopon kvantitatíve adszoribeáltatunfc. A >allilkrein-inaktivátor eluálása kvantitatíve megoldható 2,0 pH-értékű 0,25 mól KCl/HCHufferoldattal. 2.2.) Szarvasmarhapanlkreászból előállított, perklórsavval fehérjemenitesített és Sephadex G—25 ioncserélővel sómentesített 2,00 000 I mU tripszin aktivitású kivonatot használunk kiindulóanyagként. A trtpszinalktivitás kb. 50%-os Kunitz-inhibitor jelenlétére vezethető vissza. A fenti kivonatot 0,2 mólos nátriumklorid és 3,0 pH-értékű pufferoldat hozziáadása után 2M-kimotripszinoszlopra visszük fel. Az oíszlopról távozó szűrletben 100 000 I mU tripszin jelenléte mutatható ki, amelyiből 1%-nál kevesebb vezethető vissza Kunitz-inhibitor jelenlétére. Az EM-kimotripszin-oszlopról távozó szűrletben jelenlevő specifikus tripszin-inhibitort végül EM-tripszin-oszlopon tisztítjuk (1. táblázat 1.2. és 1.3.). Ezzel az eljárással egyetlen műveleti lépésben sikerül a Kunitzninihibitor csaknem kvantitatív elválasztása és megtisztítása a kísérő specifikus tripszin-inhibitortól, mivel az EM-kimotripszin-oszloprál távozó szűrletet közvetlenül a tripszinKKzfopra visszük fel. Az oszlopok savas jellegű oldatokkal történő eluálása után mindkét inhibitor tiszta formában nyerhető. 3. EM-kallikrein-oszlop: 400 mg EMA^t, 7,5 pH-értékű 200 ml 0,2 mólos foszfátpufferfoen 0 C°^on rövid idő alatt homogenizálunk, a keverékhez 2 ml 1%-os hexametilén-oldatot adunk és a reafccióelegyet 0 C°-on 3 percig kevertetjülk. Ezután 20 ml 7,5 pH-értékű 0,2 mólos foszfátpufferfoen oldott 100 000 KE-t (2y protein/KE) adunk hozzá és a szuszpenziót 0—4 C° közötti hőmérsékleten éjjelen át kevertetjülk. Az EM^kallikreint (az EMA-n 99,500 KE kötődik meg) kb. négyszeres térfogatú cellulózporral elkeverjük és egy vízzel hűtött és 1 cm rétegvastagságú Sephadex— C—25-öt tartalmazó oszlopra öntjük. 5 3.1.) Az EM-fcalifceinwószlopat 0,1 mólos (+0,2 mólos nátriumklorid) 7,8 pH-értékű trietanolaminos-pufferoldattal mossuk és azt tapasztaljuk, hogy az oszloppá felvitt 80 000 KIE kalldikrein-inaktivátorból 75 000 KIE az oszlo-10 pon adszorbeálvia mairadt. 40 000 KIE-t 2 pH-értékű ammóniumacetát-pufferrel ismét eluálunk. (Kisebb oszlopok esetén az eluált kallikrein 4naktivátorra számított hozam 100%.) Az EM-kallikrein-oszlop 7,8 pH-értéken kai-. 15 likrein-inaiktivátorral ismét terhelhető, a megkötött kallilkreint tehát az eluálásnál használt 2 pH-iértékű pufferoldat nem károsítja. A kallikrein-inalktiiviátor ezen kívül 8 mólos karbamidoldattal (+0,1 mólos tóetanolarninpuffer, 20 pH 7,8) semleges pH-értáken szintén eluálható az EM^callikirein-oszlopról. A kallikrein-ánafctivátorra számított hozaim (a -karbamidnak Sephadex G—25 oszloppal történő elválasztása után) mintegy 100%-osnák adódik. Az oszlopon 25 feltehetően a kallikrein, illetve kallikreán-inaktivátor reverzibilis denaturálódása következik be és ezáltal a specifikus kallilkrtein-ihhibi. tor-molekuláris kölcsönhatás is megszűnik. Szabadalmi igénypontok: 35 1. Eljárás kallikrein-inateMvátor dúsítására, azzal jellemezve, hogy egy a kallikrein-in aktivátor által gátolt enzimet kovalens kötéssel egy hordozón megkötünk, az így keletkezett adduktot vizes oldatban kallikrein-inaktivátor olda-40 tával érintkeztetjük, a kapott komplexet kimosással tisztítjuk, az enzimes műgyantán megkötött inaktívat ort az oldathoz karhamidot adva vagy az oldat pH értékét csökkentve disszociáltatjuk, és a kallikrein-inaktivátort 45 tartalmazó oldatot elválasztjuk az enzimes műgyantától. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosíitási módja, azzal jellemezve, hogy kallik-50 rein-inafctivátorként szarvasmarha belsőszervékiből, főként tüdőből, hasnyálmirigyből, füitőmiirigy/ből és miájból készített nyers kivonatot vagy részlegesen tisztított vagy koncentrált oldatot használunk. 55 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy a kallikrein-inalktivát orral és a műgyantán megkötött tripszinnel, kimotripszinnel vagy kallikreinnel komplex vegyületet képzünk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítani módja, azzal jellemezve, hogy az inakt: -65 vátorral komplex vegyületet fcépző enzim hor-4
