157648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inaktivátor dúsítására

157648 A találmány szerinti eljárás lefolytatása során a két fentemlített komponensekből álló és a hordozóanyagon megkötött komplexet a kísérőanyagok és szennyezések eltávolítása céljából vízzel és pufiferoldatokkal alaposan kimossuk, 5 végül pedig disszociált állapotba hozzuk (diszszociáltatjuk). A disszociációt a pH érték változtatásával és/vagy az ionkoncentráció megváltoztatásával és/vagy a tripszin vonatkozásában kompetitív gátló anyagként, vagy szubsz- 10 trátumként jelentkező, pl. triptamin, £-aminokarbonsav vagy n-butilamin kiszorításával és/ vagy megfelelő adalékanyagokkal érhetjük el. Az adalékanyagok, pl. a karbaimid, alkalmasaik arra, hogy a molekuláris kölcsönhatásokat fel- 15 lazítsák, illetve feloldják, ezzel adott esetben a folyamatban résztvevő proteinek reverzibilis denaturálódását is elérhetjük. A találmány szerinti eljiárás előnye az, hogy 20 a kallikrein-inaktivátor szennyezett oldatokból való dúsítását tehetővé teszi, amely ezidáig nehézkesen és bonyolult módon volt megoldható, amellett egyszerű eszközök alkalmazásával jó hozamot és tisztasági fokot biztosít a kallikreininaktivátor tisztítására és izolálásiára. Kísérleti rész Kiinduló anyagok: oellulózpor, (Sohleicíher—Sahüli 123 ill. Cellex-X-F-1 Bio-Rad Laboratories) etilén és maleinsavanhidrid kopolimerje (DX 840—21; EMA+M, Monsanto) kristályos tripszin (Trypure NovoR, Fa

-Novo) és a-Kimotripszin {3 x kristályosított, Sehuchardt, Mümdhen) kallikrein (kb. 2 /xg protein/ /Ke 50%-os, liafilizált, Fa. Farbenfabriken Bayer) és szövetkivonatok, (hasnyálmirigyből homogenizálással előállítva, 0,1 m NaCl- vagy 0,1 m 7,8 pH értékű pufferoldatban; fehérjementesítés 6%-os perklórsavval ill. etanoladagolással.) EMA+Mnből képzett oszlop adszorbeált anyaga Megkötődött és leoldott Leoldás utáni hozam Í(%) Eluciós körülményék (pH) 1. tripszin 1.1. kallikreininaktivátor 90—100 1.2. tripszininhiibitor; sertéspankreászból i(sómentesített kivonat) 80—100 1.3. tripszin-inhibitor; egérondóíholyagíból (fehérjementesített kivonat, sómentesítés nélkül) 75 2. kimotripszin 2.1. kallikrein-inaktivátor kb. 100 2.2. szarvasmarha pankreász-kivonat (Kunitz-inhibitor, Tripszin-inhibitor) kb. 90 2,0 2,0 2,0 2,5-2,0 2,5-2,0 3. kallikrein 3.1. kallikrein-Jinaktivátor 00-^100 30 50—400 3,5 6,0 (8 mólos karbamid) Kísérleti körülmények: (A megadott számok a táblázat adataira vonatkoznak.) A leírásban szereplő egység rövidítések magyarázata a következő: U = nemezetközi enziinegység 45 50 (I,«, mól szubsztrátum átalakításához szükség menynyiség normál kísérleti körülmények között) 1 mTJ: 1000 U IU = inhibitoregység (az enzimalktivitás 1 egységgel való csökkenését idézi elő) 1 ImU = 1000 IU TlmU = tripszin milliegység KE = baliilkrteinegység KIE = Kallikrein-55 inhibitoregység (Recommendations of the International Union of Biochemásty, Elsevier Puibl. 60 Amsterdam, 1965) (v.o. Trantsdhold et. al. „Neue Aspekte der Trasylol-Therapie", R. Gross és G. Kroneberg 5 oldal, Schattauer Verlag, Stuttgart 1966) 1. EM-tripszin: Az EM^tripszin-cellulóz-oszlop előállítása és a kallikrein-inaktivátor kivonatokból történő adszorpciója (1.1.), az adszor-65 beált anyag oszlopról történő eluálása savas •>