157552. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos adenozin-5'-foszfát előállítására

b 157552 hető AMP mennyiságévei. A hidrolízisre felhasznált kaMumhidroxid optimális mennyisége függ az eljárás módjától: a) bepárolt kivonat használata esetén az AMP mért mennyiségének 60—100%-a; b) bepárolaílan kivonat, vagy c) nyers ATP szubsztancia esetén annak 2—íjszorosa szükséges. A reagensek mennyiségét más esetékiben is a kiindulási elméleti AMP tartalomra adjuk meg. A hidrolízist mindhárom esetben legelőnyösebben 40 C°-on 24 óráig végezhetjük. Nem koncentrált eredeti izoirnkivonat (b) esetében ugyanígy bevált a 70 C°-on 30—80 percig tartó hidrolízis is. (Ez esetiben a 70 C°-ra való melegítés legfeljebb 30 percet vehet igénybe.) Ilyen körülmények között végzett hidrolízis esetén [az a), b) és c) esetiben egyaránt] kimutatható mennyiségű adenin vagy adenozin nem szabadul fél, ADP és ATP sem mutatható ki a hidrolízis utáni szűrletben, az elméleti AMP-nak pedig közel 90%^a kivonható pH 7,5—8,5 között a hidrolízis közeg csapadékából. A csapadék ilyen kivonatolása az eredeti kivonatból (b) készült hidrdlizátummal 70 C°-on 15 percig történik. BepároQt kivonat (a), különösen pedig nyers ATP oldat (c) használata esetén célszerű a hozam, emelése céljából néhány vizes utóextrakei át végezni a hidrolízis közeg csapadékából. 'Az így nyert egyesített AMP tartalmú oldatból, melynek számított AMP koncén tració ja maximálisan 3 g/l, a hatóanyagot a kiindulási AMP-re számítva 17-szeras moláris feleslegű Hg(II)-, vagy Pb(II)^acetáttal választjuk le sója alakjában. Úgy találtuk, hogy igen fontos az acetát hozzáadása előtt az oldalt pH értékét 5 és 7 közöttire, előnyösen 6-ra állítani ecetsavval, majd az ólom- vagy higianyacetát savanyú, 20—40%-os oldatban történő kis részletekben való bevitele után a pH-t alkálifémhidroxiddal 7,0—j8,0-j

ra, előnyösen 7,6-ra állítani, az adenilát leválása ilyen körülmények között 2—5 CJ

on 3 óra alatt optimális. Méréseink szerint az ólomaoetát használata a higanyaöetáttal szemben a leválasztásnál nem jár hátránnyaj és gazdaságosabb. Az AMP ólomsóját tartalmazó csapadélkot ezután kb. 2-szeres térfogatú vízzel mossuk, majd a csapadékot a só megbontása céljából (1 g AMP-re 40 ml) vízben szuszpendálva HoS gázzal telítjük és a gázt addig vezetjük át rajta, amíg az PbS kiválása teljessé nem válik. A csapadék színének feketére való változása után a kénhidrogén bevezetését még 30—60 percig folytatjuk. A levált ólomszulfidot oentrifugálás után az előző szuszpendáláshoz használt vízmennyiség felét kitevő forró, (80—90 C°) vízzel 1—2-szer mossuk, majd centrifugán elválasztjuk. Higanysó leválasztása esetén azonos módon járhatunk el. Az egyesített AMP tartalmú szűrlet (kb. 1% tényleges AMP tartalom) kilevegőztetés után használható az AMP acetonos kicsapáshoz, ill. kristályosításához. Ezt a kísérletek alapján úgy célszerű végezni, hogy először kezdődő zavarosodásig adagoljuk az aoetont, majd 24—48 óra hűtés köziben (4—5 C°) tovább emeljük a hozzáadott aceton mennyiségét három térfogatra (75 tf.%). Az így nyert szűrletből további aceton hatásara már nem válik le anyag. A csapadékot szűrjük, majd acetonos mosás után szárítjuk. Ha az AMP-sav levegőztetett oldatából nátriumhidroxiddal való neutra'lizálás után végezzük az acetonos leválasztást, a végtermék az AMP dinátriumsója, amorf csapadék. Tapasztalataink szerint azonban a nátriumsó leválasztása a kiíhozatal és tisztaság szempontjából előnytelenebb. A kristályos AMP-sav dihidrát végtermékek analízise azt mutatta, hogy a foszfortartalom, valamint az adenin komponens uv. spektrofotometriás vizsgálata szerint tisztaságuk 90—95% közöitit mozog, légszáraz anyagra számítva. Papírikromatográfiásan (W. E. Cohn, C. E. Carter, J. Am. Chem. Soc. 72, 4273, 1950) a végtermék homogénnek bizonyult. Atkristályosítás kb. 20% veszteséggel járt és a termék fentiek szerint mért tisztaságát nem javította. A leírt eljárással a lähus-lkivonat összes adenozin-ifoszfáttartalmáira számított elméleti AMP-mennyiség 50—62%-a nyerhető ki kristályos AMP-dihidrát formájában. Ez azt jelenti, hogy a rendelkezésünkre álló kiindulási anyagminőségnél 1 kg nyers lóhús kivonatból átlagosan 0,75 g, 1 kg szárított lóhús kivonatlból 3,1 g AMP állítható elő. Figyelembe véve a korábbi módszerekkel való összehasonlító kísérleteinket, ez az eredmény kedvező, különös tekintettel az ipari felhasználás lehetőségeire. 1 kg nyers lóhúsból kivonható 1,25 g ATP-^ból ugyanis az ATP izolálás veszteségeit nem számítva is, csak 0,61 g AMP volna nyerhető az irodalomban szereplő eljárások alkalmazásával. 1. példa: 1 kg szárított lóhúsnak megfelelő fehérjementesített 9 liter kivonatban papírkromatográfiás mérés alapján 6,5 g ATP; 2,2 g ADP; 1,1 g AMP van. Ennek alapján a kivonatból elméletileg előállítható AMP mennyisége 7,33 g. A kivonatból történő közvetlen uv. spektrofotometriás mérés szerint ugyanezen AMP mennyiség 7,2 g. A kivonathoz 20 g p.a. minőségű kalciumhidroxidot adtunk, keverés köziben 30 perc alatt 70 C°-ra melegítettük és 40 percig kevertük. Ezután a pH-t sósavval 8-ra állítottuk be, majd a hidrolizátumot centrifugáltuk. Az oldat pH-ját ecetsavval 6-ra állítottuk és keverés közben 310 ml 40%-os Fb(II)-acetátot (124 g) adagoltunk hozzá, végül a pH-t 20%-os nátriumhidroxid oldattal 7,6-ra állítottuk, 4—5 C°-on történő 3 órás állás után a csapadékot centrifugáltuk, majd 500 ml desztillált vízzel mostuk. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3