157501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citotetrinek előállítására
157501 7 ' 8 gezzük. A vizes vagy vizes alkoholos oldatok citotetrin tartalmának meghatározásánál a hígítást csupán 20'%-os metanollal végezzük. A standard görbe két szélső pontja 25, ill. 100 /tg/ml. A standard citotetrin oldat +4°C-on sötétben (500/o^os metanolos oldatban) 2 hétig teljesen stabil. A fenti úton előállított antibiotikum bázisos tulajdonságú, narancsvörös színű anyag. Szénen, hidrogénen, oxigénen, és nitrogénen kívül más elemeket nem tartalmaz. A citotetrin komplex különféle, elsősorban megosztásos módszerekkel több, legalább öt aktív komponensre bontható szét. Az egyes komponensek fizikai-kémiai és biológiai tulajdonságai igen nagymértékben hasonlítanák egymáshoz, és egymástól legjobban csupán különleges kromatográfiás módszerekkel, illetve egyes fizikai-kémiai és biológiai tulajdonságai kismértékű eltérése alapján különböztethetők meg. Az erjesztéses oldatból a citotetrin több különféle módon, de legelőnyösebben extrakciós módszerrel vonható ki. A gomba tenyésztésénél a citotetrin mind az oldatban, mind pedig a miicéliumtömeghez kötve megtalálható. Éppen ezért célszerűen úgy járunk el, hogy az erjesztéses oldatból a micéliumot gyengén savas, célszerűen 4—5-ös pH-n szűréssel elkülönítjük, majd a kapott nedves micéliumtömeget valamely vízzel elegyedő neutrális szerves oldószerrel, célszerűen metanollal extraháljuk. Az extraktumot csökkentett nyomáson történő desztillációval oldószermentesítjük, ós a vizes maradékot, mely a micéliumhoz kötődött antibiotikumnak csaknem teljes mennyiségét tartalmazza, egyesítjük az erjesztéses oldat szürletével. így elérhető, hogy az antibiotikum teljes mennyiségét vizes oldatban kapjuk meg. Természetesen eljárhatunk úgy is, hogy a citotetrint mind az erjesztéses oldat szürletéből, mind pedig a micé'liumtömegből különkülön, vagy a teljes erjesztéses oldat együttes extrakci ójával (metanollal, ill. etilacetáttal) nyerjük ki. A fenti módon vagy bármely más úton előállított vizes oldataiból a citotetrin többféle módszerrel nyerhető ki. Legelőnyösebb módszer, ha a citotetrint semleges vagy gyengén lúgos pH-n, célszerűen pH 6—9 között, valamely vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, legelőnyösebben butanollal, etilacetáttal, kloroformmal, metilizobutilketonnal, diklóretánnal vagy hasonlókkal vonjuk ki. A kivonás után kapott szerves oldószeres fázisból a hatóanyag protonált (só) formájában újra vizes fázisba vihető át. Ezt úgy érhetjük el, hogy a szerves fázisból az antibiotikumot enyhén savas pH-jú vizes oldatokkal, célszerűen híg vizes, szerves vagy szervetlen savakkal, pufferoldatokkal extraháljuk. A savas extrakciónál a pH-t legelőnyösebben 2—6 között tartjuk. Az egyes oldószerek esetében az extrakcióban alkalmazható pH- és térfogat-viszonyokat a következő táblázatból állapíthatjuk meg. E táblázat a citotetrin megoszlási hányadosának pH-tól való függését mutatja különböző pH-jú vizes pufferoldatok és egyes szerves oldószerek között. 5 K = \-vizi^oldószer pH Butanol Kloroform Etilacetát 20,0 300,0 3,8 40,0 1,6 11,0 0,6 0.8 0,17 0,2 0,09 0,0 A savas-vizes kivonás után az antibiotikum a vizes oldat neutralizálása, illetve gyenge meglúgosítása után újra szerves fázisba vihető át. A vizes fázis pH-jának növelésére bármely vízben oldódó szerves vagy szervetlen bázis (alkálihidroxidok, alkálikarbonátok, alkálihidrogénkarbonátok, ammóniumhidroxid, piridin, trietilamin stb.) alkalmazható. A fenti lépések tetszőleges számú megismétlése nemcsak az antibiotikum nagyfokú békoncentrálódását, hanem igen nagymértékű tisztulását, a semleges és savas jellegű szennyezésektől való megszabadulását is eredményezi. A fenti módszerrel mindezen túlmenőleg az egyes aktív komponensek részleges elválasztására is mód nyílik, minthogy az egyes aktív komponensek megoszlási és oldhatósági viszonyai között csekély különbségek tapasztalhatók. Kielégítő mértékű tisztuláshoz elegendő a fenti tisztítási lépéseket háromszor végrehajtani. A szilárd antibiotikum-komplex kinyerésére a legalkalmasabb módszer a többszörös megosztás után kapott szerves oldószeres fázisnak csökkentett nyomáson szirupsűrűségig történő bepárlása után a citotetrin lecsapása apoláros szerves oldószerekkel (petroléter, ligroin, hexán stb.). Ebben az esetben a citotetrint szabad bázis formájában kapjuk meg. A megfelelően betöményített vizes extraktokból csekély polaritású szerves oldószerekkel (aceton, díoxán stb.) a megfelelő citotetrin sók csaphatók le. A citotetrin leszűrt erjesztéses oldatokból vagy más vizes oldataiból történő kinyerésének egy másik előnyös megvalósítási módszere a citotetrin bázis kationcserélő gyantákon történő megkötése segítségével vihető keresztül. A megkötésre alkalmazhatunk karboxil-típusú (Amberlite IRC-50, Wofatit CP 300 stb.) vagy szulfonsav típusú (Amberlite IR 120, Dowex 50 stb.) kationcserélő gyantákat. A megkötést célszerűen hidrogén-ciklusban végezzük. A megkötésre kerülő oldat pH-ja 4 és 7 között, előnyösen pH 5 körül lehet. Az antibiotikum leoldására hígított vizes savak oldatai, vagy szervetlen sókat pl. nátriumkloridot tartalmazó vizes, alkoholos oldatok a legelőnyösebbek. Az így nyert eluátumokból a citotetrin ezután vagy közvetlen le-15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
