157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

157415 37 38 alatt fokozatosan 0,6 ml/pere értékre növeljük, és ezt a sebességet tartjuk a kísérlet végéig. Az eiuátumot 24 ml-es frakciókban gyűjtjük, és a kívánt terméket a 25—72. frakciókból kapjuk olyan módon, hogy a pH-t 9,5-re állít- 5 juk be 50%-os nátriumhidroxid oldattal, majd fagyasztva szárítást végzünk. A maradékot metanollal .extraháljuk, az extraktumot vákuumban 40 C°~on szárazra töményítjük, és a maradékot kis mennyiségű vízben oldjuk. Az oldat 10 pH-ját tömény sósavval 3,5-re állítjuk be. Az oldatot fagyasztva szárítjuk. így a kívánt terméket kapjuk, amelyet vizes etanolból átkristályosítunk. 15 17. példa: Összesen 3 millimól femlalanm-amidot felveszünk 30 ml li0,2-es pH-jú káliumiborát-puf- 20 feríben. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük, és 3 millimól N^karboxi-aszpartmsavanhidridet adunk hozzá gyors keverés közben, A reakciót egy percen át folytatjuk, és a pH-t tömény kánsavval 4-ire állítjuk be, miközben nitrogén- 25 -áramot vezetünk át az elegyen. Négy perc eltelte után a hidrogénion-konoentrációt 10,2-es. pH-nak megfelelő értékre állítjuk be tömény káliumlhidroxid oldat hozzá- 30 adásával. A reakció elegyet ismét 0 C°-ra hűtjük le, és gyors keverés közben 3,45 milliimól N-kairiboxi-metioninanhidridet adunk hozzá. 3 perc eltelte után a pH-t tömény kénsavval 4-re állítjuk be, és 15 percen át nitrogén-áramot bu- 35 barékoltíatunk át az elegyen. A dekariboxilezés után képzőidő csapadékot feloldjuk olyan mádon, hogy a pH-t tömény káliumlhidroxid oldattal 10,,2-re állítjuk be. Az oldatot 1 C°-ra hűtjük le, és gyors keverés 40 közben 4,6 millimól N-karboxi-triptofananhidridet adunk hozzá. A pH-t vizes káliumhidroxid oldat szakaszos hozzáadásaival 10,2-es értéken tartjuk. A reakcióelegyet szűréssel megtisztítjuk, és a szűredék pH-ját tömény sósav hozzá- 45 adásával 2,0-ra állítjuk be. A szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk. Az oldatot (közelítőleg 50 ml) 1O00 g Sephadex G—25 oszlopon (finomszemicsés anyag; 7,5 cm 50 átmérő, 1O0 cm hossz) kromatográfiaijuk. Az oszlopot ionmentesített vízzel eluáljuk, és 100 ml-es .frakciókat gyűjtünk. A 39. és a 40. frakció a reagálatlan metionin-aszpartil-ifenilalanil-amid tripeptidet tartalmazza. Meghatározatlan 55 szerkezetű egyéb kisebb frakciókat nyerünk a 41—59. oldatfrakcioklból. A kívánt terméket a 60—64. frakciók egyesítése után úgy nyerjük, hogy az eredeti pH-t (7,4) tömény sósavval 2-re állítjuk be, majd az oldatot fagyasztva szárít- 60 juk. A termék azonosságát és optikai tisztaságát Spinco-analízissel, továbbá leuein-aminopeptidázzal, vagyis L-aminosavakra specifikus enzimmel végzett hidrolízis útján állapítjuk meg. A Spinco-analízis eredménye azt mutatja, 65 hogy a várt aminosavak a számított arányban vannak jelen. Az enzimatikus hidrolízissel nyert elegyet vékonyréteg-kramatográf iával elemezzük meg, vizsgálati reagensként ninhidrint használva. A kromatgram a kiindulási aminosavak mindegyikének megfelelő foltokat mutat, és nincsenek sem közibenső termékeknek megfelelő, sem pedig terméknek megfelelő foltok. Ez a két utóbbi tényező rendkívül fontos. Ha ugyanis optikai inverzió ment volna végbe a reakció közben, vagy termékéket, vagy közbenső tepmékeket, vagy pedig mindkettőt találnánk a kromatiogramon. Ennek az az oka, hogy az enzimatikus hidrolízis az enzim optikai speeiificitása következtében megállna az invertált aminosavnál. 18. példa: Elegyedő és nem-elegyedő oldószerek használata. Üvegcső-készüléket szerkesztünk. Ez egy vízszintes szakaszból áll, amelynek közepén buborékszerű nagyobb rész helyezkedik el. Egy hengerpohánhoz jeges sófürdőben vezető üvegcső-szakasz ágazik el a buiborékszerű részből, és azzal összéköttetJésben van. A vízszintes csőszakasz mindkét vége fölfelé folytatódik, és ezekhez az elágazásokhoz injekciós fecskendők csatlakoznak. A fecskendők a reagensek előzőleg lehűtött oldatait tartalmazzák elegyedő vagy nem-elegyedő oldószerekben. A fecskendőket egyidejűleg működtetjük, úgyhogy az oldatok lényegileg azonos időben érik el a kitágult szakaszt. Sebességük következtében az oldatok tunbulenciát idéznek elő a reakciózónában, aminek folytán a reagensek bensőleg elegyednék. A reakció végbemegy, és az N-karboxi-peptid a lefelé elágazó csövön keresztül a hengerpolháiiha folyik. Kb. két perc eltelte után a Ihengerpohárban dekarboxilezést végzünk olyan módon, hogy gyors keverés közben tömény sósavat adagolunk a reabcióelegyhez, miközben nitrogént áramoltatunk rajta keresztül. Egy ilyen kísérlet során 2 ml dioxánban és 18 ml vízben 85 mg (0,44 millimól) N-karboxi-fenilalanin-anhidridet adagolunk kb. 3 C°-ra hűtve az egyik fecskendőbe, és 20 ml káliumborát oldatban 42 mg (0,40 millimól) szerint adagolunk a másik fecskendőbe. Az oldatokat a reakciózónában összehozzuk, majd a hengerpohárba folytatjuk. 90 másodperc elteltével a terméket a hengerpohárban 3-as pH-n gyors keverés közben tömény sósavval dekaríboxilezésnek vetjük alá, miközben állandóan nitrogénáramot vezetünk át a reakcióelegyen 15 percen át. Ezután a reakcióelegyet fagyasztva szárítjuk, és a maradékot metanollal extraháljuk. A metanolos oldatot szilikagél-oszlopon kromatografáljuk, és az oszlopot 4:1:5 arányú n-butanol-ecetsav-víz rendszerrel hívjuk elő. Az