157369. lajstromszámú szabadalom • Eljárás leucinaminopeptidáz kvantitatív kolorimetriás meghatározása

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1968. II. 23. (AE—250) Német Demokratikus Köztársaság-béli elsőbbsége: 1967. II. 27. (WP 42 1/122.928) Közzététel napja: 1969. XI. 22. Megjelent: 1970. XII. 31. 157369 Nemzetközi osztályozás: C 01 n 31/14; 33/16 V!'^ Feltalálók: Prof. Dr. Haschen Reinhard, Halle, Dr. Farr Wolfgang, Halle, Reichelt Dieter oki. vegyész, Bitterfeld, Tulajdonos: VBB Arzneirndttelwerk Dresden, Radebeul, Német Demokratikus Köztársaság Eljárás leucinaminopeptidáz kvantitatív kolorimetriás meghatározására 1 A találmány tárgya eljárás a vérplazmában és a vérszérumban levő leucinaminopeptidáz kolorimetriás, kvantitatív meghatározására. Ismeretes, hogy a leucinaminopeptidáz (LAP) enzimaktivitása kvantitatív meghatározható. Az ismert eljárásoknál specifikus szubsztrátként leucinamidot használnak (1). A leucinamidból a leucinamidpeptidáz által felszabadított leucin karboxil- (2), ill. bázisos (3) csoportja alapján titrimetriás úton kvantitatív meghatározható. Az enzim hatására felszabadult leucin a leucinamidtól felszálló papirkromatográfiás úton elválasztható, a leucin ninhidrinnel előhívható és az így kapott folt stabilizálás után Cu(II)ionokkal kolorimetrálható (4—6). A leucinamidból az enzim által felszabadított ammónia pedig bórsavval kémiailag megköthető és savval titrálható (7—9). Az amino-nitrogénnek az enzim hatására bekövetkezett növekedése ninhidrines módszerrel mérhető (10). Ezenkívül ismeretes a leucinaminopeptidáznak kromogén szubsztrátokkal történő meghatározása. A leucin-p-nitroanilidból a leucinaminopeptidáz által szabaddá tett p-nitroanilin sárga -színe alapján közvetlenül, fotometriásan mérhető (11). A leucin-/?-naf til amidből a leucinaminopeptidáz által szabaddá tett /?-naftilamin 10 15 20 25 valamely diazóniumsóval reakcióba vihető és a keletkező színes vegyület kolorimetriásan meghatározható (12—15). Ezeknek az ismert eljárásoknak azonban számos hátránya van. A körülményes munkamódszer, nagy időráfordítás és nem kielégítő érzékenységük miatt — pl. a leucinamid kimutatásánál —• ezek az eljárások rutinelemzésre nem alkalmasak. A kromogén szubsztrátokkal történő kimutatás nem eléggé specifikus, mivel a p-nitroanilidek és a /S-naftilamidok aminosav-arilamidázokkal túlnyomórészt hidrolizálhatók (16). A jelen találmány célja olyan eljárás kidolgozása a leucinaminopeptidáz meghatározására, amely kiváltképpen a májparenchima klinikai diagnosztikájában érzékeny kimutatási módszer, és rutinelemzésként használható. A találmány feladata volt olyan szubsztrátot találni a meghatározáshoz, amely a leucinaminopeptidázra specifikus, amelynek hasadási terméke egyszerű és kimutatási reakcióval nagy érzékenységgel meghatározható. Azt találtuk, hogy a leucinaminopeptidáz az L-Leucin-hidrazidot L-Leucinra és hidrazinra 3C képes hidrolízis útján elbontani, ugyanolyan 157369