157369. lajstromszámú szabadalom • Eljárás leucinaminopeptidáz kvantitatív kolorimetriás meghatározása
157369 fokban és specifitással és azonos feltételek mellett, mint a leucinaminopeptidázhoz ismert és specifikus szübsztrátként használt L-Leucinamidot. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy a meghatározandó leucinaminopeptidázt tartalmazó vizsgálati anyagot L-Leucinhidraziddal vagy DL-leucinhidraraziddal hozzuk össze és a leucinaminopeptidáz által hidrolizis útján lehasított hirazint valamely aromás aldehiddel, előnyösen p-dimetilaminobenzaldehiddel sárga színezékké alakítjuk. A L-Leucinhidrazid hidrolízisét a leucinaminopeptidázzal 9,0—10,2 pH-értéken inkubálva végezzük. A leucinaminopeptidáz által az L-leucinhidrazidból szabaddá tett hidrazinnak pl. p-dimetilaminobenzaldehiddel történő kapcsolásával egyidejűen az oldat pH-értékét 7 alá állítjuk, s így a kondenzálás útján képződött sárga színezék narancsvörös festéksót képez. Ennek a festéksónak a moláris abszorpciós Koefficiense igen nagy, úgy, hogy a leucinaminopeptidáz kimutatásának érzékenysége ezzel a módszerrel az ismert eljárásokkal összehasonlítva jelentékenyen növekszik. Az oldat megsavanyítása következtében megszüntetjük az enzimreakciót. A festéksónak a leucinaminopeptidáz menynyiségével arányos extinkcióját a 455 nm-en levő abszorpciós maximumnál mérjük. A találmány szerinti eljárás a léucinaminopeptidáznak a vérszérumban vagy a vérplazmában történő meghatározását gyors és kvantitatív módon teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás az ismert eljárásokkal összehasonlítva még azzal az előnnyel is rendelkezik, hogy nagymértékben specifikus és nagy érzékenységű. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: Eljárás külön aktiválás nélkül 0,5 ml s'zubsztrált-puffer-oldatot (4 rész 0,2 M 10,15 pH-értékű monoetanolamin-puffer és 1 rész 112 mM, vizes, leucinhidrazinoldat) 25 C°-ra temperálunk és 0,2 ml szérummal vagy enzimoldattal meghatározott ideig (szérumnál 60 perc) inkubáljuk. 5 ml, 1 rész p-dimetilbenzaidehid oldatból( 4 g p-dimetilaminobenzaldehid 100 ml 96%-os etanolban vagy metanolban) és 17 rész 0,1 N sósavból álló reagenst adunk az inkubált anyaghoz és 30 perc múlva mérjük az extinkciót a .reagenshez viszonyítva. Hasonló eredménnyel használhatunk a reagens készítéséhez más aromás aldehideket, így p-aminobenzaldehidet, p-monoalkilamino-benzaldehidet, vagy p-dialkilaminobenzaldehidet is. 2. példa: Eljárás Mg2+ -aktiválással 5 0,3 ml puffer-aktivátor-oldatat (5 rész 9,25 pH-értékű 0,25 M monoetanolamin-puffer és 1 rész 40 mM MgCtj-oldat) 0,1 ml szérummal vagy enzimoldattal 2 órán át 25 C°-on elő-inkubálunk. Ezt követően 0,1 ml 80 mM vizes 10 leucinhidrazid-oldatot adunk az elegyhez és 30 percig 25 C°-on inkubáljuk, majd 4,5 ml 1. példa szerinti reagenst adunk hozzá. A továbbiakban az 1. példa szerint járunk el. A vakpróba készítésénél az enzimoldatot a reagens hozzáele-15 gyítése után adjuk az oldathoz. IRODALOMJEGYZÉK: 20 (1) SMITH, E.L. és D.H. SPACKMANN, Leucin Aminopeptidase. V. Activation^ Specificty and Mechanism of Action. J. Biol. Chem. 212, (1955), 271—299. (2) Grassmann, E. és W. Heyde. Alkalimet-25 rische Mikrobestimmung der Aminosäuren und Peptide. Z. physiol. Chem. 183 (1929), 32—38. (3) Linderstro-Lang, K. Titrimetrische Bestimmung von Aminostickstoff, Z. physiol. Chem. 30 173, (1928), 32—50. (4) Haschen, R.J. Aktivitätsbestimmung von Peptiidasen durch quantitative Papierchromatographie. Clin. Chim. Acta 1, (1956), 242—255. 35 (5) Haschen, R.J. Bestimmung und Charakterisierung der LAP des normalen menschlichen Serums. Clin. Chim. Acta 6, (1961), 322—325. (6) Haschen, R.J. Charakterisierung und Bestimmung der Glycyl-Leucindipeptidase der 40 menschlischen Erythrozyten. Biochem. Z. 334, (1961), 569—575. (7) Conway, B.J. „Microdiffusion Analysis and Volumetrie Error" 2nd ed., p. 92, Crosby Lockwood, London, (1947). 45 (8) Hanson, H. und R.J. Haschen. Zur Charakteristik der Aminopeptidasen der Blutserums. Z. physiol. Chem. 310. (1958), 213—220. (9) Nagel, W.F. Willing és F.H. Schmidt. 50 Über die Aminosäurearylamidase — (sog. Leucinaminopeptidase) — Aktivität im menschlichen Serum, liílín. Wschr. 42, (1964), 447—449. (10) Fleischer, G.A., M. Pankow és C. 55 Warmka. Leucine Aminopeptidase im Human Serum: An ultramicromethod for the Determination of the Rates of Hydrolysis of L-Leucylglycine. Clin. Chim. Acta 9 (1964), 254—58. (11) Tuppy, H., U. Wiesbauer és E. Winters-60 berger, Aminosäure-p-nitroanilide als Substrate für Aminopeptidasen und andere proteolytische Fermente. Z. physiol. Chem. 329. (1962), 278—288. (12) Braun-Falco, O. és K. Sallfeld. Über das 65 Verhalten der Leucinaminopep'tidase-Aktivität 2
