157330. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció a vér plazminogén tartalmának meghatározására

157330 euglobuíliin előállítási eljárás és az ugyan csak önmagában ismert jelenség, mely szerint az alvadéikoldódás a jelenlevő plazmin mennyiségétől függ, a reagensek standardizálása és megfelelő arányban való alkalmazása esetén olyan gyors plazminogén-meghatározási eljáráshoz vezet, amely egyszerűsége folytán a klinikai munka praktikus és gazdaságos kisegítő eszköze lehet. Az alkalmazásra kerülő reagenskombinációt liofilizált állapotban alkalmazzuk. A meghatározást puffer-oldat jelenlétében végezzük el. Olyan puffert alkalmazunk, amely közel neutrális pH értek tartását biztosítja és a véralvadás folyamatára nem gyakorol az in vivo körülményék között végbemenő folyamatoktól lényegesen eltérő hatást. Ilyen pufferként alkalmazhatunk vizes oldatban Na-veronal-Veronai puffert (Owren). ,A puffer-öldatók előnyösen fiziológiás konyhasóoldattal felhígítva készülnek. Találmányunk tárgya továbbá eljárás a találmányunk szerinti meghatározási módszer foganatosításához alkalmas új diagnosztikum előállítása is, amelyre jellemző, hogy a hatóanyagokat a fent megadott arányban liofilizáljuk. A találmányunk értelmében megadott arány biztosítja meghatározási módszerünk gyakorlati elvégezhetőségét. Ezáltal olyan reagens van kezünkben, amely a vérben gyakorlatilag várható plazminogén-szint jelenléte esetén klinikai szempontból kedvező meghatározási időt biztosít. Találmányunk tárgya továbbá a fentiek szerint előállított reagenskombináció, amely hatóanyagként trombint, fibrinogént és streptokinázt tartalmaz liofilizált állapotban, oly módon, hogy a trombin mennyisége úgy aránylik a fibrinogen és streptokináz mennyiségéhez, mint 1—300 NIH egység: 50—300 mg: 0,01— 0,02 mg. A reagenslkomibinációt ill. a meghatározási eljárást előnyösen kiegészíthetjük liofilizált állapotban alkalmazott ismert standard plazminogén — mint kisegítő reagens — alkalmazásával. Ennek alkalmazása az eljárást meggyorsítja és lehetővé teszi a kvantitatív meghatározást. A standard plazminogént pufferten oldjuk és olyan mennyiségben alkalmazzuk, mely a streptokináz-fibrinogénntrombin oldódását 14—18 percen belül biztosítja. Ezen standardból különböző, ismert hígításokat készítünk és párhuzamos meghatározást végzünk a betegtől vett, vizsgálandó vérplazma ill. az ismert koncentrációjú standard plazminogén-hígítások összehasonlításával. A meghatározandó vérplazma plazminogén tartalma a standard hígítások valamelyikével egyező oldódási időt mutat és ez adja jó közelítéssel kvantitative a meghatározandó vérplazma plazminogén-tartalmát. A fent megadott trombin : streptokináz : fibrinogen arány mellett a 14—18 percen belüli oldódást biztosító plazminogén mennyisége 0,018—0,022 mg. Eljárásunk további részleteit a példában ismertetjük. Példa: 90 mg fibrinogént (plazminogénmentes, 94<l

/o alvasztható fehérjét tartalmaz) és 0,06 mg 5 streptoMnázt (Streptococcus haemolyticus H 46 A törzstenyeszetéből alkoholos kicsapással készült és kromatográfiásan tisztított, ultracentrifugával homogénnak mutatkozó), valamint 100 NIH-egység aktivitású trombint külön-külön 10 ampullákban, (vagy a fibrinogént és streptokinázt közös ampullában) liofilizálunk. (1 NIH-egység jelentése: 24 C°-on pH = 7,2 mellett 0,2 ml 100 mg/100 ml-es fibrinogénoldatot 17 mp alatt alvaszt meg.) Példánkban a fenti 15 reagenskombináció képezi a diagnosztikumot, mely hosszú ideig tárolható. Felhasználás előtt 10 ml pH = 7,4 vegyhatású veronálpuffer és fiziológiás konyhasó 1 : 4 arányú keverékében oldjuk a fibrinogen és strep-20 tokináz fenti mennyiségét, valamint a trombint. A vizsgálandó plazmából euglobulin oldatot készítünk Kaulla és Schultz módszere alapján a következőképpen: 1 ml plazmához 15 ml desztillált vizet adunk és Erlsnmeyer lomfoik-25 ban 4 percig CC^-vel áramoltatjuk át a lombik enyhe rázogatása közben. Centrifugálással különválasztjuk (3 perc, 1000 ford./perc) ä képződött csapadékot a többi fehérjétől. A felülúszót kvantitative eltávolítjuk. A csapadékot 1 30 ml puff erben oldjuk. Az így nyert euglobulinoldatból 0,1 ml-t 2,9 ml puffer-citrát keverékbe (9 rész puffer + 1 rész 3,8%-os nátrium-citrát) mérünk be. Ezáltal az euglobulin-oldatot 30-szorosára hígítottuk fel; a citráttal megaka-3g dályozzuk, hogy az euglobulin-oldat spontán megalvadjon. Ajánlatos az így nyert hígítást, ha nem azonnal végezzük el a további lépéseket, +4 C°-on tartani. 40 Szerológiai csövekbe vagy alvasztó-csövecskékbe 0,1 ml-t mérünk be fibrinogen és streptokináz fenti oldatából. A csöveket 37 C°-on vízfürdőben tartjuk. Ezután azonnal bemérünk a vizsgálandó plazmából készített euglobulin-45 oldat 1 : 30 hígításából 0,1 ml-t; 2 perc inkubáció után hozzáadjuk 1 NIH trombirt^mennyiség 0,1 ml vízben készült oldatát. Néhány másodperc után bekövetkezik az alvadás. A trombin hozzáadásának pillanatában stop-50 perórát indítunk el. Másodperceken belül bekövetkezik az alvadás, azonban az órával nem ezt, hanem a későbbiek során bekövetkező oldódás idejét regisztráljuk. Félpercenként, a cső döntögetésével megvizsgáljuk az alvadókot. 55 Feljegyezzük azt az időpontot, amikor az alvadék teljesen feloldódik, vagyis teljesen folyékony lesz. A kapott idő a vizsgált vér plazminogén-tartalmának -a függvénye. Célszerű a meghatározást a 3. ponttól kezdődően paral-50 iellel végezni. A kapott oldási időből kalibrációs görbe segítségével következtetünk a plaziriinogén-szintre. A kalibrációs görbe készítése úgy történik, hogy 6 biztosan egészséges 20 és 40 év közötti 65 egyén plazmájának keverékéből euglobulin ol•}