157330. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció a vér plazminogén tartalmának meghatározására

3 157330 4 zig, 223. o. 1960) módszere állandóan friss marha-plazma beszerzését és készenlétben tartását teszi szükségessé, amellett a beteg antistreptokináz titerének ingadozása, sőt az antiplazmin is nagymértékben befolyásolja az" eredményeket. Számos kazeinolitikus módszert dolgoztak ki, amelyeknek közös' lényege, hogy a kazeinből felszabaduló tirozint határozzák meg, rendszerint a Folin-reagenssel [Thrombos, Diathes. haemorrh. (Stuttg.), 14 : 545 1965; Scand. J. clin. Lab. Invest., 16:372. 1964; J. biol. Chem., 181 : 431. 1949]. A kazeinolitikus eljárások közös hátránya, hogy a kazeinkészítmények különböző tisztaságúak és a kazeinolitikus aktivitás nem is szigorúan párhuzamos a fibrinolitikus aktivitással. A plazmában ugyanis egyéb proteolitikus enzimek is vannak, amelyek szintén képesek a kazeint bontani. Ugyanez vonatkozik a szintetikus észtereket alkalmazó eljárásokra is (J. biol. Chem., 232 : 285. 958; J. biol. Chem., 208 :85. 1954). A kazeinolitikus módszereknél is kell. valamely aktivátort — rendszerint streptokinázt — alkalmazni; ilyenkor külön hibaforrást jelent az antistreptokináz tivC" nagyfokú ingadozása. Ujabban urokinázt is használnak aktivátornak, hogy ezt kiküszöböljék [Thrombos. Diathes. hemorrh. (Stuttg.), 17 : 8. 1967.], azonban az urokináz jelenleg még drága. További ismert módszer szerint (C. A. 49 4068/f) a vizsgálandó plazmából plazminogént izolálnak, hosszadalmas módszerrel protaminszulfát segítségével és az ily módon nyert plazminogént határozzák meg. E módszer hátránya, hogy a plazminogén kicsapódása nem teljes és az antiplazmin egy része a plazminogén mellett marad. További módszer szerint (C. A. 63 16876/a) magában a plazmában határozzák meg a plazminogén-tartalmat, a bekövetkezett alvadás után fibrinogen, streptokináz és trombin segítségével. A módszer azonban pontatlan, mivel a- vérplazmában levő antiplazmin és antistreptokináz befolyásolja a mérés alapjául szolgáló oldódást. Egy további módszernél [Pathol. Biol. Sem. Hop. 14 (1966) 513] Kunitz inhibitor segítségével titráljiák a streptökinázzal plazminná aktivált plazminogént. Ez az eljárás is túl hosszadalmas ahhoz, hogy klinikai használata a gyakorlatban bevezetésre kerülhessen. Nanninga [Thrombos. Diathes. haemorrh. (Stuttg.), 17 : 8. 1967] eljárása szerint az aktiválást urokinázzal végzik és a fibrinogén-oldat turbiditásának változásából következtetnek a fibrinogén^szintre fotometriás eljárással. A módszer hátránya a műszerigény és az urokináz nehéz hozzáférhetősége. Berg és munkatársai [Thrombos. Diathes. haemorrh. (Stuttg.), 16 :1. 1966] a plazma erős hígításával igyekeznék az antiplazmin és antistreptokináz szerepét kikapcsolni. Ha az antistreptokináz-aktivitás magas, az eljárás félrevezető eredményt adhat. Standard plazminogén-készítmény is szükséges az eljáráshoz tiszta fibrinogénen és streptokinázon kívül. Az eddig alkalmazott eljárások közös vonása tehát, hogy elvégzésük hosszadalmas ill. speciális laboratóriumi adottságokat követel, az előnyösebbnek látszó megoldások pedig rendkívül költségesek. Ezért a rutinszerű alkalmazás kórházi laboratóriumokban nem, vagy csak körülményesen valósítható meg. Különös jelentőséggel bír az a probléma, hogy a hosszú meghatározási idő (egy-két nap) a legtöbb esetben meghiúsítja azt a gyors tájékozódást, amelyre a klinikai munka során szükség volna és amely a különben inkább elméleti jelentőségű módszereket gyakorlati segédeszközzé teheti. A találmányunk szerinti eljárás a vér plazminogén tartalma meghatározásának idejét 45— 70 percre szállítja le, a meghatározási módszer egyszerű és az alkalmazott reagenskombináció igen gazdaságos. -Jelen találmányunk tárgya eljárás és reagenskombináció a vér plazminogéntartalmának meghatározására oly módon, hogy trombint, fibrinogént és streptokinázt liofilizálunk úgy, hogy a trombin mennyiségének a fibrinogen és streptokináz mennyiségéhez viszonyított aránya 1—300 NIH-egység: 50—300 mg : 0,1—0,2 mg legyen, majd kívánt esetben 7,2—7,5 pH érték mellett a vizsgálandó vérplazmából desztillált vizes közegben széndioxiddal készült euglobulinhígítást a fenti diagnosztikummal reagáltatva alvadást idézünk elő és mérjük az alvadék feloldásának időtartamát. (A NIH-egység definícióját a példában részletezzük.) Eljárásunk azon az ismert tényen alapul, hogy streptokináz hatására a plazminogén plazminná alakulva a véralvadékot feloldja. Amenynyiben tehát biztosítjuk, hogy a vizsgált rendszerben más, az alvadást befolyásoló tényező ne legyen jelen, ismert mennyiségű és megfelelő arányú, streptokinázt fibrinogént és trombint tartalmazó rendszerben a véralvadék feloldásának időtartama kizárólag az ismeretlen mennyiségű, a vizsgálandó plazmától származó plazminogén mennyiségétől fog függeni és így ennék meghatározására alkalmas. Találmányunk értelmében tehát úgy vitelezzük ki a klinikai meghatározásra alkalmas gyors módszert, hogy a megfelelő arányban előkészített reagenskombinációt alkalmazzuk és a vérplazmát megszabadítjuk azoktól az inhibitoroktól, amelyek a mérést befolyásolhatnák. Találmányunk eljárásának foganatosításakor első lépésként a vérplazmát desztillált vízben vesszük fel és rövid ideig szénsavat áramoltatunk az oldatba, a képződő csapadékot eltávolítjuk és pufferben oldjuk. Az így nyert euglobulinoldat mentes az inhibitoroktól és megfelelő hígításban alkalmas arra, hogy meghatározásunk alapanyagaként szolgáljon. Az euglobulin oldat elkészítése mintegy 10 percet vesz igénybe. Pufferként előnyösen veronáloldatot alkalmazunk. Találmányunk alapja tehát az a felismerés, hogy az önmagában — más célokra — ismert 10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 2