157077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására
157077 15 alakjában kb. 210 C° bomlásponttal. Szilikagélen készített vékonyrétegkromatogrammon az alábbi R/-értekéket mutatja: R/ kloroform-metanol R/ (43 A) R/ (100) (9:1) rendszerben 0,17 0,62 0,87 10. H-Lys(BOC)-P,ro-Val-Gly-Lys(BOG)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys{BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val~Tyr-Pro-NH2 4,97 g védett tetradekapeptidamidot melegítés közben 100 ml metanolban oldunk és 1 g 10 %-os palládiumos szén hozzáadása után szobahőmérsékleten és normál nyomáson, a képződő széndioxid abszorpciója közben telítésig hidrogénezzük. A katalizátort leszűrjük, a szűrletet kb. 15 ml-re betöményítjük és a hidrogénezett tetradekapeptidet 50 ml benzol és 150 ml petroléter hozzáadásával kicsapjuk, leszűrjük és nagy vákuumban 45 C°-on szárítjuk. 4,25 g amorf port kapunk, ez szilikagélen készített vékonyrétegkromatogrammon egységes és az alábbi R/-értékekkel rendelkezik: R/ (43 A) R/ (52) R/ (100) 0,18 0,41 0,33 11. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 600 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH-t és 630 mg H-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2-t 12 ml piridinnel, 1 ml vízzel és 0,3 ml n sósavval elegyítünk. Ezután 200 mg diciklohexilkarbodiimid 1,5 ml piridinnel készített oldatát adjuk hozzá és 5 órán át 45—50C°-on keverjük, majd további 150 mg diciklohexilkarbodiimidet adagolunk és éjszakán át 45 C°-on keverjük. A kondenzációs termék és a diciklohexilkarbamid elegyét 160 ml víz hozzáadásával kicsapjuk, leszűrjük és szárítjuk. A diciklohexilkarbamid elkülönítésére a terméket kétszer egymás után forró etanolban szuszpendáljuk, ill. részlegesen oldjuk, majd benzol és petroléter hozzáadásával újra lecsapjuk. Äz így előtisztított anyagot az 1. példa szerinti módon, ellenáramú megosztással tisztítjuk. 120 megosztó lépés után metanol-puffer-kloroform-széntetraklorid (10:3:5:4) oldószer-rendszerben (puffer: 28,5 ml jégecet + 19,25 g ammóniumacetát 960 ml vízben) a 46—58 frakciókból (megoszlási szám K = 0.82) kapjuk a tiszta- védett tetrakozapeptidamidot. Szilikagél-lemezeken készített vékonyrétegkromatogrammokon a védett peptid-származék az alábbi R/-értékeket mutatja: 10 15 25 30 35 40 45 50 55 60 63 16 Rf (52) 0.54. Rf (100) 0,35 R/ kloroform-metanol (7:3) rendszer 0,4 12. H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg--Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-NEb (ecetsavas só) . A védőcsoportok lehasítását a védett peptide bői és a trifluorecetsavas só átalakítását ecetsavas sóvá az 1. példa szerinti módon valósítjuk meg. A szabad tetrakozapeptidamid papírelektroforézis esetén (Schleicher & Schüll papír, 2043/b mg 1; piridinacetát puffer, pH = = 6,35; futtatási idő 1 óra; 2000 V/8 cm futtatási hosszat mutat a katóddal szemben. A vékonyrétegkromatográfiás mérések az alábbi Rfértékeket mutatják: 20 Rf (101) aluminiumoxid-lemezen Rf (52 A) aluminiumoxid-lemezen Rf (101 E) cellulóz lemezen 0,58 0,44 0,46 3. példa Száraz anyagokat tartalmazó ampullát készítünk az alábbi komponensekből: D-SerM>íleVLys17 ' 18 -^ 24 -kortikotropinhexaacetát 0,5 mg ZnS04 -|-7 H 2 0 1,23 mg Na3 P04+12H 2 0 1,38 mg Mannit 40,0 mg Használat előtt a száraz ampulla tartalmát oldószer-ampullában levő 1 ml desztillált vízzel keverjük össze. így 7,6 pH-jú szuszpenziót kapunk. 4. példa Oldatot készítünk az alábbi komponensekből: D-Seri-Nle^-Lys^-^i-^-kortikotropinhexaacetát 0,5 mg Zselatin 280,0 mg Fenol 5,0 mg Deszt. víz ad 1,0 ml 5. példa D-Serí-Nle^-Lys^^M^-kortikotropin-hexaacetát sterilen szűrt vizes oldatát aszeptikus körülmények között nátrium-polifloretinfoszfáttal és nátriumkloriddal elkeverjük, ampullákba töltjük és liofilizáljuk. Az ampulla az alábbi komponenseket tartalmazza: D-Ser^Nle^Lys^-^-M-kortikotropin-hexaacetát 0,5 mg Nátrium-polifloretinfoszfát (86,5%-os) 23,20 mg NaCl ' 12,28 mg
