157077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására
13 157077 .4 és 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 100 ml vízzel és 200 ml n-butanollal elegyítjük. A vizes fázis elválasztása után a szerves fázist egymást követően 10 %-os borkősavoldattal (0 C°-on), telített nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és telített nátriumszulfát-oldattal mossuk, nátriumszulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A habszerű maradékot előtisztítás céljából metanol-ecetészter-petroléfer elegyből, majd metanoí-acetonitril elegyből kicsapjuk. Így 12,15 g amorf port kapunk, amit metanol-0,1 m ammóniumacetát-oldat-kioroform-széntetraklorid (9:3:4:4) oldószer-rendszerben 25 ml-es fázistérfogatokban. 250 lépésben megosztunk. A 81-—115 megosztóelemekből (i"max = 91, K = 0,í57) szárazra bepárolva és az ammóniumacetátot nagy vákuumban 45 C°-on elszublimálva összesen 7,94 g kromatográfiásan tiszta, védett pentapeptidet kapunk fehér, amorf por alakjában. Szilikagélen készített vékonyrétegkromatogrammon az alábbi R/-értékéket kapjuk: R/ kloroform-metanol (9:1) rendszerben 0,42 R/ (43 A) 0,68 6. H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 5,72 g Z-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 -t 75 ml metanolban feloldunk és 600 mg 10 %-os palládiumos szén hozzáadása után szobahőmérsékleten C02-abszorpció közben hidrogénezzük. A hidrogén felvétel kb. 5 óra múlva befejeződik, a katalizátort leszűrjük és az oldatot szárazra pároljuk. 4,74 g pentapeptidamidot kapunk amorf, kromatográfiásan egységes por alakjában, amely szilikagélen készített vékonyrétegkromatogrammon az alábbi R/-értékeket mutatja: R/ (52) 0,40 R/ (100) 0,35 7. Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NiH2 3,35 g, az 1. példa szerinti módon előállított Z-Lys(BOC)-Lys(BQC)-Pro-QH-t 20 ml abszolút dimetilformamidban oldunk és 0,65 ml trietilamin hozzáadása után —15 C°-ra hűtjük. Ezután —15 C°-on 0,i58 ml pivaloilkloridot csepegtetünk hozzá. 6 perc múlva 3,34 g H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 10 ml abszolút dimetilformamiddal készített, lehűtött oldatát adjuk hozzá és az elegyet 20 percen át —10 C°-on, 5 órán át 0 C°-on és 2 órán át 20 C°-on keverjük. A feldolgozás során 70 ml jégecetet és 50 ml vizet adunk hozzá és a szerves fázist egymást követően 0,1 m citromsavval, 2 %-os ammónia-oldattal és vízzel extraháljuk, nátriumszulfáton szárítjuk és az oldószert bepároljuk. Az. amorf por maradék (5,74 g) szilikagélen készttett vékonyrétegkromatogrammon csak csekély mennyiségű szennyeződést mutat és tisztítás nélkül használhatjuk a további reakciókhoz. R/ kloroform-metanol (9:1) rendszerben 0,23 8. H-Lys(BQC)-Lys(BOe)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 A fentiekben ismertetett oktapeptid-származék 5,7 g-ját 100 ml metanolban oldjuk és 550 mg 10 %-os palládiumos szén hozzáadása után normál nyomáson telítésig hidrogénezzük. A katalizátort leszűrjük, metanollal utánaöblítjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A fehér habszerű maradékot 100 ml kloroformban féloldjuk, 20 ml 2n ecetsavval extraháljuk, a kloroform fázist 20 ml-re bepároljuk. A peptidet 60 ml petroléter hozzáadásával kicsapjuk és 50 C°-on nagy vákuumban szárítjuk. 5,21 g légszáraz, amorf, vékonyrétegkromatográfiásan egységes port kapunk; titrálási és elementár analízis eredmények szerint 1 mól oktapeptidamid 0,63 mól ecetsavat és 13 mól EL>0-t tartalmaz. Szilikagélen az alábbi R/ — értékeket kapjuk: R/ kloroform-metanol (9:1) rendszerben 0,08 R/ (100) 0,46 9. Z-Lys(BOC)-Pro-Val~Gly-Lys:(BOC)-Lys<BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 3,91 g Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH-NH2 -t (ld. 1214 242 sz. német szabadalmi leírás) gyenge melegítés közben 40 ml abszolút dimetilformamidban feloldunk, —20 C°-ra hűtjük és ezen a hőmérsékleten, keverés közben lassan 6,58 ml 2,15 n sósavval, majd 0,74 ml 5n nátriumnitrit-oldattal elegyítjük. Ezután még 15 percen át —10 C°-on keverjük, majd 4,07 g H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 (amely 2,5% CH3 COOH-t és 15,3% H 2 0-t tartalmaz) 11 ml dimetilformamiddal készített, lehűtött oldatát, valamint 1,98 ml trietilamint adunk hozzá. Az elegyet 1 órán át 0 C°-on- keverjük, ezután a pH-t trietilamin hozzáadásával 7,5-re beállítjuk és éjszakán át 0 C°-on állni hagyjuk. A reakcióelegyet nagy vákuumban kb. 20 ml térfogatra bepároljuk és 100 ml vízzel elegyítjük. A nyerstermék kocsonyás alakban válik le. Leszűrjük, vízzel mossuk, majd háromszor metanol-víz és kétszer metanol-benzol-petroléter elegyből kicsapjuk. Az így tisztított anyagot (4,72 g) metanol-pufferkloroform-széntetraklorid (12:4:9:3) oldószer rendszerben (pufifér: 28,5 ml jégecet +19,25 g ammóniumacetát 960 ml vízben) Craig-megosztásnak vetjük alá 160 lépésben 20 ml-es fázistérfogatokban. A 45—74 megosztó elemekből szárazra való bepárlással és az ammóniumacetátot 45 C°-on nagy vákuumban elszublimálva összesen 3,3 g kromatográfiásan tiszta, védett tetradekapeptidet kapunk fehér, amorf por 10 15 20 25 3C 35 « 45 50 55 60 10 15 20 25 3C 35 « 45 50 55 60
