156896. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyengített rubella-vírus előállítására

3 156896 4 tek inkubálása 30 C° és 38 C° között bármely hőmérsékletien elvégezhető, célszerűen 30—34 C° (optimálisan 32 C°), vagy 35—38 C° (optimálisan 36 C°) hőmérsékleti értékeken dolgozunk. Az izolálása műveletek pl. az alábbi két művelettel végezhetők: A.l. A rubella vírust klinikai anyagból, vagyis rubellas megbetegedésben szenvedő beteg toroktamponjából izoláljuk és kacsaembrió szövettenyészetre visszük fel. A.2. A rubella vírust klinikai anyagból izoláljuk és grivet-majomvese tenyészetre visszük át. B. A gyengített élő rubella vírus vakcina tenyésztése. Az A. műveleti részben rubella vírusként izolált anyagot kacsaembrió szövettenyészetet tartalmazó üvegedényekbe adagoljuk. A kacsaembrió szövettenyészetet kib. 10 napos kacsaembriók felvagdalásával és tripszinnel való kezelésével készítjük. A szövettenyészet közege tetszés szerinti lehet, rendszerint olyant használunk, amely a sejtnövekedést elősegíti, így pl. a 199-es számmal jelölt ismert közeget használjuk, amelyhez borjúszérumot adagolunk. A vírus hozzáadása után a beoltott szövettenyészetet több egymást követő szakaszban 30—38 C°, célszerűen 30—34 Cc (optimálisan 32 C°) és 35— 38 C° (optimálisan 36 C°) hőmérsékleti értékeken inkubáljuk. A tenyésztési szakaszok közben a vírus nagy mennyiségben szaporodik, és egyben gyengítette válik. Az előbb említett sorozatos tenyésztési szakaszokat úgy készítjük el, hogy higítatlan vagy hígított oltóanyagot használunk, és különböző időszakaszokban a felszaporodott tenyészetet öszegyűjtjük. A grivet-majomvese szövetből készített tenyészet titerét megállapítjuk. Megfelelő időszakaszokban a tenyészeteket megközelítően 1000 TDID50 egységnyi vírusgyengítő tulajdonságokkal rendelkező más vírussal i(EGHOn, Bunyanwera stb.) kezeljük. A kémcsöves tenyészeteknél az ellenvírus távolléte esetén —• sejtkórtani úton megállapítva — 3—4 napos utókezelési szakaszt végzünk az ellenvírussal és ezeket rubella vírussal fertőzöttnek tekintjük. Ezután a vírustenyészetet összegyűjtjük és fagyasztott állapotban vagy más alacsony hőmérsékleten tároljuk, arra ügyelve, hogy a szer fertőzéses jellegét megőrizzük. C. Az ismételt sorozatos tenyésztési szakaszokból összegyűjtött rubella-vírus majmok és rágcsálók esetébien nem mutatkozott patogénnek és emberi felhasználás során is csak gyenge tüneteket okozott, emellett azonban a vírust semlegesítő ellenanyagszintet kielégítő mértékben biztosítja. A vírus fertőző jellegét megfelelő stabilizálószer, mint szaccharóz, emberi albumin, glutamin, foszfát vagy ezek keverékének hozzáadásával fenntartjuk. A virus hatékonysági titerének megállapítása után az összegyűjtött vírust több részre osztjuk és ampullákba letöltjük. Az előállított termék tárolható és fagyasztott állapotban, vagy célszerűen liofilizáló szárítás után a nedvesség kizárása mellett száraz állapotban adagolható. A találmány szerinti eljárás további részleteit az alábbi kiviteli példák kapcsán szemléltetjük. 1. példa: A kezdeti oltóanyagot az A.l. művelettel nyerjük. 5 9—11 napos kacsaembriókat lefejezünk és a végtagokat eltávolítjuk, az embriót aszeptikus körülmények között finomra vagdaljuk és a felvagdalt szövetet Hanks'B.S.S.-vel több részletben mossuk. A moisott szövetet 36 C°-on 0,25%-10 os tripszin (Difco 1:250) trisz-sós pufferes oldatával 2—3 óra hosszat kezeljük. A tripszinnel kezelt sejtszuszpenziót kettős vastagságban alkalmazott steril kötőgézen összegyűjtjük és 1500 fordulatszám mellett 5 percig centrifugáljuk. A 15 tamponált sejteket a tenyésztési közegben megszámlálás céljából ismét szuszpendáljuk. A tenyésztési közeg 199-es számú közegből (Morgan, J. F., Morton, H. J. és Parker R.X., Proc. Soc. Exp. Bioi. and Med., 73:1—8, 1950) áll, amely 20 2% gamma borjúszérumot (melyet 30 percig 56 C°-ra melegítünk) és 50 mcg/ml Neomycint tartalmaz. A palack-tenyészetet úgy állítjuk be, hogy milliliterenként 250 000 csíraképes sejtet tartalmazzon. Ezután 36 C°-on a tenyészetet 25 36—48 óra hosszat inkubáljuk és a palack tenyészeteket felhasználhatjuk a sorozat tenyészetekben vagy a vakcinakészítés során. A kacsaembrió szövettenyészetet üvegpalackokban állítjuk elő, amelyek tenyésztési közeg,.Q

ként 199 számú közeget és 2% inaktivált borjúszérumot tartalmaznak. 3—4 nap utótenyésztés után a közegben levő tenyészetet aszeptikus körülmények között leszivatjuk és a palack tenyészeteket 100—100 ml Hanks'B.S.S. anyaggal négyszer mossuk, majd palackonként 2,5 ml fent említett higítatlan oltócsíraként használt rubella-vírussal beoltjuk. Minden egyes palack tenyészethez 60 ml 199 számú közeget adunk, amely 10%-nyi mennyiségben valamely alkalmas, a vírus fertőző képességét stabilizáló szert 40 tartalmaz. A palackokat' 30—34 C° közötti hőmérsékleten inkubáljuk. A tenyésztési és fenntartó közegbe 50 mcg/ml koncentrációban Neomycint adagolunk. 2—4 napos időközökben az összegyűlt tenyészeteket kinyerjük és a palack 45 tenyészeteket a fenti stabilizálószert tartalmazó friss fenntartó közeggel ismét megtöltjük. Tíz egymást követő szakaszban végezzük a tenyésztést, minden szakaszban kb. 32 C° hőmérsékletet állítunk be. Az összegyűjtött tenyészeteket fertőző zőképesség szempontjából grivet-majomvese szövettenyészeteken titráljuk. Minden egyes tenyészetet aszeptikus körülmények között steril tartályba töltünk le, mikrobás sterilitási tesztekre mintákat veszünk és a megmaradt anyagot 55 szárazjég-alkoholos fürdőben kifagyasztjuk. A vírust tartalmazó folyadékot elektromos hűtőegységben —70 C°-on tároljuk, mielőtt a vakcina készítéséhez a megfelelő tenyészetet vagy tenyészeteket kiválasztanánk. A vakcina készíté-60 séhez kiválasztott tenyészetet fertőzőképesség szempontjából megtitráljuk. A kiválasztott anyagot a hűtőberendezésből kivesszük és megolvasztjuk. Egy mintát ellenőrzési és biztonsági tesztekre félreteszünk. A megmaradt folyadékot 65 derítjük és újabb mintát veszünk ki majmokon 9