156544. lajstromszámú szabadalom • Eljárás influenza-vakcina előállítására
156544 3 4 a szuszpenzió mentes a fertőző influenzavírusoktól és pirogénektől. Az inaktiválás során az etilétert előnyösen helyettesíthetjük etilacetáttal. Az ember- vagy állatgyógyászatban való szubkután vagy intramuszkuláris alkalmazásra az inaktivált vírusrészecskék így kapott vizes szuszpenzióját egy növényi vagy ásványi olaj vagy egy természetes hidrofil triglicerid és egy alkalmas emulgálószer keverékében emulgálva tartós, könnyen alkalmazható szuszpenziót kapunk. Növényi olajként előnyösen szójaolajat használhatunk, de szezámolaj, földimogyoróolaj vagy olívaolaj is megfelel. Természetes hidrofil trigliiceridként például olajsavas vagy palmitosztearinsavas trigliceridek polioxietilénnel kondenzált termékei használhatók. Emulgálószerként előnyösen alkalmazható mannitoleát. Az emulziót hagyományos módon készíthetjük, például az inaktivált vírusszuszpenzió és a két adalék olajos keverékét 0 C° körül gyorsan keverve. így tisztított hemagglutinin-emulziót kapunk, amely alkalmas emberek vagy állatok immunizálására. Ez az emulzió szubkután vagy intramuszkulárisan alkalmazható vakcina. Az inaktivált vírus-szuszpenzió közvetlenül is felhasználható, például az orrba porlasztva. E célból porlasztó flakonokba vagy gáz- vagy folyadékszóróval ellátott tartályokba tölthető finom cseppecskékből vagy aeroszolból álló diszperzióként való alkalmazásra. Rektális alkalmazásra az inaktivált vírusrészecskék vizes szuszpenzióját a végbélkúpok valamely szokásos alapanyagába keverjük. A fentiek egyszerű oltóanyagok előállítására vonatkoznak. Kombinált vakcina készítésére elég külön-íkülön előállított tisztított hemagglutiimin-szuszpenziókat összekeverni, (majd a fent leírt módon az olajos adalékokkal egyesíteni. A találmány szerinti eljárással kapott influenza-vakcinák kiváló immunizáló hatásukkal, a létrehozott immunitás tartósságával, könnyű alkalmazhatóságukkal (szubkután, intramuszkuláris, nazális vagy rektális úton) és pirogénmentességükkel igen lényeges haladást jelentenek ezen a területen. A technikai haladás többek között abban is megnyilvánul, hogy a találmány szerinti eljárással készült vakcina közvetlenül beporlasztiható a légzőutakba, ellentétben a Davenport és munkatársai idézett közleményében leírt módon előállított két készítménnyel. A formaldehides inaktiválás elmaradása következtében ugyanis a hemagglutinin megtartja neuramidináz aktivitását, és így a vakcina alkalmas a légzési szervek nyálkahártyáinak közvetlen immunizálására. További előnye a találmány szerinti eljárással készült vakcinának az emulgált alakban való előállíthatósága. Ez teljesen új kikészítési forma ezen a területen, és nagy előnyöket nyújt terápiai szempontból, különösen az eltűrhetőség és az immunitás tartóssága tekintetében. Az alábbi példákban ismertetjük — korlátozás szándéka nélkül — a találmány gyakorlati végrehajtását. 1. példa: Az A2 influenzavírus A 2 /England/l/66, a B influenzavírus b/Roumanie/2/66 törzsét, az Ai influenzavírus Ann Arbor/l/5i7 törzsét vagy a londoni World Influenza Centre gyűjteményéből való bármely más A, Ai, A2 vagy B antigén típusú emberi influenzavírus-törzset 10 napig inkubált tyúktojás allantoiszában tenyésztünk. A beoltott tojásokat 48—72 óra hosszat 37 C°-on tartjuk, majd 18 óra hosszat 4 C°-on, közben eltávolítva azokat a tojásokat, amelyekben az embrió elhalt. A hűtés után a beoltott tojások allantoisz-folyadékát vízlégszivattyúval kiszívatjuk, és 500—1000 ml keverékké egyesítjük. A keverék vírustartalmát a hemagglutinációs reakció és in ovo titrálás útján határozzuk meg. Az oltóanyag hígítását és a beoltott tojások inkubációjának tartamát a használt törzsnek megfelelően változtatva arra törekszünk, hogy a vírusszuszpenzió ml-ére számítva 512 és 2048 közötti hemagglutináz-egység (HAE/ml) tartalmú alapoldatot kapjunk. Ezeket az alapoldatokat azután kis sebességű (kb. 1000 g) centrifugálással 15 percig derítjük, majd a felső folyadékréteget 40 000 g-vel 60 percig preparatív ultracentrifugán centrifugáljuk. A kapott üledéket újra homogénen szuszpendáljuk 1 tf. izotóniás foszfát pufferban [7,2 pH; R. Dulbocoo .és M. Vogt: J. Exp. Med. 99, 167 (1954)]. Ezután ezt a koncentrált szuszpenziót fokozatosan növekvő sűrűségű káliumtartarát vagy szacharóz oldatban preparatív ultracentrifugán centrifugáljuk [C. E. Schwerdt és F. L. Schaff er: Virology 2, 665 (1956); J. F. MoCrea és munkatársai: Nature 189, 220 (1861)]. A legnagyobb HAE/ml koncentrációjú frakciókat egyesítve legalább 5000 HAE/mg fehérje tartalmú vírusszuszpenziót kapunk. Ez a szuszpenzió azután izotonikus foszfátpufferral 1000—2000 HAE/ml vírustartalmúra hígítható. A fent leírt módon kapott tisztított vírusszuszpenzió 1 térfogatához 2 térfogat peroxidmentes etilétert és 1 mg/ml polioxi-etilén-szorbitolmonooleátot (Tween 80) adunk. Ezt a keveréket olvadó jégfürdőbe helyezzük, és lapátos keverővel aszeptikus körülmények között 5 óra hosszat keverjük. Az étert és a megtisztított hemagglutininból álló vírusszuszpenziót dekantálással elválasztjuk, és az éter maradékát vákuumban elűzzük. Ez után a kezelés után a szokásos módszerekkel meghatározzuk a HAE/ml értéket. Rendszerint azt tapasztaljuk, hogy az nagyobb az eredeti koncentrációnál. Ezután cellulózészter-hártyán (közepes pórusméret 0,45 mikron) át leszűrjük a tisztított hemagglutinint minden szennyezés eltávolítására. A baktérium- és gombamentességi próbákat a szokásos módon hajtjuk végre tioglikolátos táptalajon, a National Institute of Health agaros táptalaján, Sabouraud agaros táptalaján és különleges dúsított Mycoplasma táptalajon. A viszszamaradt fertőző influenzavírustól való mentességet az éteres kezelés után különféle hígításokkal végrehajtott egymást követő két átvitel-15 20 25 Í0 35 40 45 50 55 60 2
