156374. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos alakú kallikrein-inaktivátor előállítására

156374 3 4 tiszta vízmentes kallikrein-inaktivátor aktivitása 7500 KIE/mg. A hatóanyag 4-élű hasábok alakjában kristályosodik. A kristályok egy vagy több éle olykor ferde síklkal van levágva. Míg azok a kal'likrein-inaktivátor kristályok, amelyeket ammóniumszulfát-oldatból 6 pH-értéknél kristályosítottak, röntgen-felvételben monoklin rendszerűeknek és a P 2± tércsoportba tartozóknak bizonyultak, addig a találmány szerinti eljárással előállított kristályok rombos rendszerűek és a P 2|2i21

tércsoportba tartoznak. Az ibolyántúli színkép tekintetében is határozott különbség van e kétféle termék között. Az új kristályos termék vízben nehezen oldódik, a pH-érték csökkentése esetén azonban oldhatóvá válik. így elegendő pl. széndioxidot vezetni a kristályok vizes szuszpenziójába, az oldás biztosítása végett. Az oldhatóság meghatározása esetén tehát szükséges a levegő széndioxid tartalmának kizárása. Ilyen körülmények között 100 ml-nél több vízre van szükség ahhoz, hogy 20 C° hőmérsékleten 1 g kristályt tökéletesen oldjunk, míg a magnéziumszulfát- vagy ammóniumszulfátoldatból nyert kristályok oldhatósága e hőmérsékleten kb. 30%. A foszforpentoxid felett szárított anyag specifikus hatásossága kb. 0,14 y/KIE. A kristályok vizes szuszpenziójának pH^értéke kereken 10. Ha némi savat adunk a szuszpenzióhoz, a kristályoik !kb. 9 vagy ennél kisebb pH-értéknél oldatba mennek. Az eljárás kivitele előnyösen oly módon történhet, hogy a pH-értéket ammóniával állítjuk be. Alkalmazhatók azonban erre a célra más szervetlen vagy szerves bázisok is. Különösen jó hozamot érünk el, ha ammóniát alkalmazunk és 11 vagy ennél nagyobb pH-értóken dolgozunk. A kristályosodást hűtéssel is elősegíthetjük. A kristályosítás céljaira előnyös koncentráció 1% és 5% között van; a kallikrein-inaktivátor ennél kisebb koncentrációja esetén a hozam gyengébb. Ha ammónia helyett más bázist alkalmazunk, akikor a beállítandó pH-érték optimuma természetesen a fentitől eltérő lehet; a legkedvezőbb pH-érték kísérletileg könnyen megáUapítható. 1% végső koncentrációnál nátronlúg, kálilúg, kalciumhidroxid és báriumhidiroxid esetében a kristályosodás szempontjából legkedvezőbb pH-érték 11. Szerves bázisok esetében a pH-érték optimumla szintén 11 körül van. A legjobb kristályosodást szerves bázisok esetében etiléndiaminnal érjük él; jó eredményeket kapunk továbbá metilamin, trimetilamin, trietilamin, piperidin és hasonlók alkalmazása esetén is. A kallikrein-inaktivátor semleges vagy savas oldatának vákuumban történő bepárlása esetén a legnagyobb koncentrációk mellett sem kapjuk a hatóanyagot kristályos alakban. Ha azonban az oldatot egy erősen bázisös anioncserélővel töltött oszlopon vezetjük lassan keresztül, akkor erősen alkalikus oldatot kapunk, amelyből betöményítés esetén a kallikrein-inaktivátor bázisos alakban jó hozammal kristályosodik ki 9 és 10 pH-érték között. Kiindulóanyagként legjobban az olyan kallíkreiii-inaktivátor készítményeik alkalmazhatók, amelyek messzemenően mentesítve vannak a hatástalan kísérőanyagoktól. Minél nagyobb mértékű a készítmény tisztasága, annál jobb hozammal megy végbe a kristályosítás. A találmány szerinti eljárás megvalósíthatósága nem volt előrelátható. Nem ismeretes az irodalomból oly példa, amely szerint valamely a kallikrein-ináktivátorhoz (M: 6500) hasonlóan nagy molekulasúlyú polipeptid egy meghatározott pH-érték egyszerű beállítása útján kristályos alakba hozható. Meglepő volt az is, hogy a kallikrein-inaktivátor 9 pH-érték fölött ilyen nagyfokú stabilitást mutat. Az irodalom ugyanis többször említi, hogy az inaktivátor alkalikus pH-tartományban instabil. Ezért az irodalom ajánlatosnak mondja az inaktivátor oldatainak semlegesítését, minthogy az inaktivátor érzékeny az alkalikus pH-értékekkel szemben. A bázis kristályosítása útján a kallikrein-inaktivátor mentesíthető az idegen fehérjéktől és más kísérőanyagoktól. Mindazok a gyógyászati alkalmazási lehetőségek, amelyek a nem-kristályos inaktivátor esetében fennállnak, az új kristályos termék esetében is érvényesek. Ezen túlmenően az új kristályos termék még további, lényegesen új és számottevő haladást jelentő felhasználási lehetőségeket biztosít. Nehezen oldható volta következtében ugyanis ez a kristályos termék púder alakjában is elkészíthető. Az ilyen púder alakú készítmény jól alkalmazható a műtétek utáni összenövések megelőzésére. A műtét alatt az ilyen készítményt bevisszük a hasüregbe, ahol az nehezen oldódó volta miatt sokáig megmarad. Az ilyen púder elkészítése a szokásos módszerekkel történhet. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: 4,48 g liofilizált kallikrein-inaktivátor készítményt, amelynek tisztasági foka 0,16 y/KIE = = 28 mega-KIE, feloldunk 56 ml kétszer desztillált vízben. A kapott oldat 1 ml-e tehát 500 000 KIE hatóanyagot tartalmaz. Ezután 56 ml tiszta 25%-os ammóniumhidroxidot adunk hozzá. 24 órai állás alatt (20 C° hőmérsékleten) sűrű kristálypép válik le, ezt keményített szűrőn leszívatással szűrjük, 12 ml kétszer desztillált vízzel mossuk és evakuált foszforpentoxidos exszikkátorban megszárítjuk. Ily módon 3,096 g kristályt (22,12 mega-KIE) kapunk, amelynek tisztasági foka 0,14 y/KIE. A hozam tehát az elméleti mennyiség 79%-a. 2. példa: 20 ml kallikrein-inaktivátor-oldathoz, amelynek hatóanyag-tartalma 2 mega-KIE, tisztasági 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2