156374. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos alakú kallikrein-inaktivátor előállítására

5 156374 6 foka 0,16 y/KIE, 0,63 ml telített baritvizet adunk. 4 C° hőmérsékleten történő 10 órai állás után a levált kristályokat keményített szűrőpapíron át leszűrjük, vízzel mossuk és foszforpentoxid felett, vákuumban megszárítjuk. 129 mg kristályos terméket kapunk (920 000 KIE). A termék tisztasági foka 0,14 y/KIE; hozam 46%. 3. példa: 0,48 g 0,16 y/KIE tisztasági fokú kallikrein-inaktivátort 20 ml vízben oldunk és 0,39 ml etiléndiamint adunk hozzá. A kristályosodás már 15 perc múlva megkezdődik. A 24 óra alatt kapott kristálypópet elkülönítjük, kevés vízzel mossuk és megszárítjuk. Ily módon 239 mg kristályos terméket kapunk, amelynek tisztasági foka 0,142 y/KIE. Ez 56%-os hozamnak felel meg. 4. példa: 1 g liofilizált kallikrein-inaktivator készítményt, amelynek tisztasági foka 0,2 y/KIE (== 5 megia-KIE) 10 ml kétszer desztillált vízben oldunk. Ezután 0,6 ml 25%-os ammóniát adunk hozzá. 24 órai állás után (4 C°-on) a levált kristályokat leszűrjük, mossuk és megszárítjuk. Ily módon 2.10 mg kristályos terméket kapunk, amelynek tisztasági foka 0,15 y/KIE. Ez 28%-os termelési hányadnak felel meg. 5. példa: 3,4 g liofilizált kallikrein-inaktivátort, amelynek tisztasági foka 0,17 y/KIE, 150 ml vízben oldunk. Az oldat pH-értéke 6,5. Ezután 50 ml erősen bázisos anioncserélőgyantát (Amberlite IRA 410) adunk hozzá.A szuszpenziót 10 percig keverjük, majd 24 óra hosszat állni hagyjuk. Ekkor a szuszpenzió 10,5 pH-értéket mutat. Felszuszpendálás és szitán keresztüli szűrés útján az ioncserélőt elkülönítjük a kristályszuszpenziótól, a levált kristályokat leszűrjük, kevés vízzel mossuk és megszárítjuk. Ily módon 2,03 g kristályos termékeit kapunk, amelynek tisztasági foka 0,145 y/KIE; ez 70 %-os termelési hányadnak felel meg. 6. példa: 15,4 liter erősen savas kallikrein-inaktivator oldatot, amely 295 mllió KIE hatóanyagot tartalmaz, 0,16 y/KIE tisztasági fokban, 6 óra alatt átfolyatunk egy 5 liter erősen bázisos OH-alakban levő anioncserélő gyantával (Amberlite IRA 410) töltött oszlopon. A kapott erősen alkalikus oldatot cirkulációs vákuum-bepárlóban 1,5 liter térfogatra töményítjük be. Az oldat már a betöményítés közben zavarosodni kezd és végül a kiindulóanyagként alkalmazott kallikrein-inaktivator 71%-a kristályos alakban leválik. A 0,14 y/KIE tisztaságiban kapott kristályos terméket a szokásos módon elkülönítjük. 7. példa: 5 Egy 1,5%K>S, 6,0 pH-értékű kallikrein-inaktivátor-oldat 20 ml-jéhez 0,14 ml 30%-os vizes metilamin-oldatot adunk. Az így kapott oldatból, amelynek pH-értéke 11, kb. 2 óra múlva 10 kristályok kezdenek kiválni. A kristályosodás befejeződése után a kapott kristályokat leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. 0,14 g kristályos kallikrein-inaktivátort (az elméleti hozam 47%-a) kapunk. 15 8. példa: 20 ml 1,5%-os kallikrein-inaktivátor-oldathoz, . amelynek pH-értéke 6.0. hozzáadunk 0,96 ml 20 45%-os trimetilamin-oldatot. Az így kapott oldatból, amelynek pH-értéke 11, kb. 2 óra múlva kristályok kezdenék kiválni. A kristályosodás befejeződése után — amihez kb. 24 órai állás szükséges — a levált kristályokat szűrés-25 sei elkülönítjük és vákuumban megszárítjuk. 0.12 g kristályos kallikrein-inaiktivátort (az elméleti hozam 40%-a) kapunk. 9. példa: 30 200 ml 1,5%-os kalli;krein-inaktivátor-o.ldatot, amelynek pH-értéke 6,0, 1,1 g szilárd trietilamin bekeverése útján 11,1 pH-értékre állítunk. Kb. 2 óra múlva megkezdődik a kristályok ki-35 válása. 24 óra hosszat szobahőfokon állni hagyjuk az elegyet, majd a levált kristályokat leszívatással szűrjük és vákuumban megszárítjuk. 1,45 g kristályos kallikrein-inaktivátort (az elméleti hozam 48i%-a) kapunk. 40 A fenti példákban leírt eljárással kapott kristályos kallikrein-inaktivator orto-romibos rendszerű, 4 élű, egyes élein ferde síkkal levágott alakú kristályokat képez. A kapott kristályok röntgen-diagramjának adatai: 45 cella a: 43,3 Á, b: 49,0 A, c: 23,3 A tércsoport P 21

2i2t V 49 500 A3 50 A kristályos termék infravörös és ibolyántúli színképét — a leírás bevezető részében említett, gyengén savas közegből (pH = 6,0) magnéziumszulfáttal kristályosított termék színké-55 pével összehasonlítva — a csatolt rajz szemlélteti. A rajzon az 1. ábra az ismert korábbi terméknek, a 2. ábra a jelen találmány szerinti eljárással kapott tiszta kristályos kallikrein-inaktivátornak az infravörös színképét, a 3. ábra 60 pedig a kétféle termék ibolyántúli színképét (egy diagramra felvitt alakban) mutatja. Ez utóbbi ábrán balról az első vonal a .magnéziumszulfát ibolyántúli színképe 1 g/liter koncentrációban, a középső görbe a magnéziumszulfáttal kristályosított fcallikrein-inaktivátoré 65 0.987 g/liter koncentrációban, a -jobboldali gör-3