156318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás borjúvese sejttörzsek kitenyésztésére

3 Az utóbbi időben több olyan emberi és állati megbetegedést okozó vírust találtaik, amelyeket borjúvese tenyészetben ki lehet mutatni és el lehet szaporítani, ennek ellenére az American Type Culture Collection Cell Repository (Rock- 5 ville, Maryland), mely a kutatók sejtivonalakkal és sejttörzsékkel való ellátásával foglalkozik, nem tenyésztett ki borjúvese sejttörzseket. MDBK jelzésű borjúvese sejtjeik csak sejtvonaliként jellemezhetők. Fenti szervezet gyűjte- 10 menyében 41 sejtvonal mellett csak egy — hörcsög eredetű — sejttarzs szerepel. Ismeretes az 1,070.764 sz. angol szabadalmi leírás, mely szerint diploid sejttörzseket állítanak 15 elő. A kiindulási szerv fcütyavese és hátránya a költséges és komplikált tápfolyadék. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott borjúvese előnye, a kutyavesével szemben, hogy annak vírusérzékenységi skálája szélesebb és 20 főképpen borjaik vírusos megbetegedései elleni vakcinák alapanyagainak alkalmasabbak. A találmány szerintii eljárással kialakított sejttörzsön a borjak vírusos hasmenésének vírusa, a szarvasmarhák rhinotraaheitis vírusa, a bovin 25 berpesvírusok, valamint a bovin adenovírusok 4. típusa elszaporodik. A találmány célja borjúvese sejttörzsek kitenyésztése oly módon, hogy a kitenyésztett s0 törzsek a normális, fajira jellemző kromoszóma garnitúrával rendelkezzenek, tehát ún. diploid sejttörzsek legyenek, iés a tenyészet hosszabb időn át aktív szaporodásban tartható legyen. Az ily módon készített tenyészet egyenletes mi- 35 nőségénél fogva az esetleges primer tenyészeteknél vírusok szaporítására alkalmasabb. A találmány tárgya eljárás borjúvese sejttörzsek kitenyésztésére, borjúernbrióból vagy 40 fiatal borjúból származó vese 0,2%-os tripszinnel történő kezelésiével készített primer tenyészetből, oly módon, hogy az összefüggő sejtbevonat képződése után azt a tenyésztőedényben 1—i2 csepp 0,2%-os tripszinnel kezeljük, a 45 tripszin hátasára V2—3

/Í

óra alatt leválott sejteket 89,5% Hanks-dldatot, 10% bika- vagy borjúsavót és 0,,5%, bidrölizált láktaűibumint tartalmazó tápfolvadékban szuszpendálva átoltjuk, a sejtek ily módon végzett átoltását — a 50 törzseket 38 C°^os termosztátban tartva — 4—6 naponként ismételjük, mimellett a tenyészeteket minden át oltásnál a kétszeresére szaporítjuk. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a 55 csekély mennyiségben alkalmazott tripszin a sejteket nem károsítja, továbbá, hogy a sejték az egyszerű összetételű tápfolyadékban is kielégítően fejlődnek. Ezzel a módszerrel a borjúvese sejttörzseiket V2—1 éven át, 40—'60 pasz- 60 százsban aktív szaporodásban lehet tartani. A találmány szerinti eljárás jól reprodukálható. Ezideig öt borjiúemlbrió és egy fiatal borjú veséjéből alakítottunk ki sejttörzsöket. Ha félévenként újabb veséből kiindulva új tovább- 6

5 oltási sorozatot indítunk meg, folyamatosan megfelelő sejttörzsek birtokában lehetünk. A Moorhead^móds2erével Végzett kromoszóma vizsgálatokkal kimutattuk, hogy az általunk kialakított borjiúvese sejttörzsek a normális, fajra jellemző kromoszóma garnitúráival rendelkeznek, tehát diploid sejttörzsek. Végül a találmány szerinti eljárással kitenyésztett borjúvese sejttörzsek előnye, hogy vírusok iránti érzékenységük igen kiterjedt. így fogékonyak az emberi és állati adenovírusok, az ember, szarvasmarha, ló és sertés herpesz vírusai, a borjak vírusos hasmenésének vírusai, valamint a baramfipestis vírusa iránt. Mivel sejttörzsékiről van szó, ezek biológiai és • biokémiai vizsgálatokban, valamint vakcinák előállításában való felhasználásra alkalmasak. A találmány szerinti tenyészet készítését az alábbiakban részleteiben ismertetjük. Példa: Boirjúembriából vagy fiatal borjúból származó veséből először primer tenyészetet készítünk. A vesét a sebészet aszeptikus szabályai szerint eltávolítjuk, majd steril laboratóriumban, steril eszközöket használva Petri-csészébe helyezzük és sebészeti csipesszel és ollóval kb. 2 mm-es fcoakáikra felaprítjuk. A szövetdarabkákat tripszin-oldatban szuszpendáljuk és 37 C°-on keverjük mindaddig, míg a tripszin hatására a sejtek a szövetből kiszabadulnak. A sejteket a tripsziniből kíméletes centrifugálással elválasztjuk, majd tápfolyadékban szuszpendálva üvegedényekbe visszük át, amelyeket 37 C°-os termosztátban oly módon helyezünk el, hogy a sejtek szaporodásához megfelelő felület álljon rendelkezésre. A sejtek megtapadásuk után szaporodásnak indulnak, majd az edény felületén egy rétegű sejtbevonat ot képeznék. A fentiekben használt tripszin-oldatot a következőképpen készítjük el: 2 g tripszint 1 ldter foSzfát^pufferoldatíban feloldunk. A foszfátpuff er összetétele: 8 Na'Cl, 0,2 g »Cl, Jl,lS g NaaHPOí és 0,2 g KH2P0

4 oldata 800 ml, üvegből desztillált vízben. Az oldat sterilezése G 5 üvegszűrőn való szűréssel történik. A tripszin hatásfoka: 1 :1000 hígítása tripszin-törzsöldatot tovább hígítva, filmen levő zselátiníbevonatat az 1500—200 hígítás 45 perc alatt oldja. A tápfdlyadék összetétele mind a primer tenyészet - készítésénél, mind pedig a későbbiek folyamán a sejttöírzsek tenyésztésénél a következő : 89,5% Hanks-oldat, 0,5% lak'talbumiin^hidrolizétum, 10 % borjú- vagy bikása vó. 2