156318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás borjúvese sejttörzsek kitenyésztésére
156318 6 A Hanks-oldat összetétele: A-oldat: 80 g NalCl, 4 g KOI, 2 g MgS04, 1,4 g CaCi2, 0,6 g KH2P0 4 és 0,2 g fenolvörös, 9000 ml, üvegből desztillált vízben. Az oldat sterile- 5 zése aütoklávban történőik. B-oldat: 1,,2 g N!a2 HP0 4 -l!2:H 2 0, 10 g glukóz, 1 millió egység ^-penicillin, 1 g sztreptomicin, 100 ml üvegből desztillált vízben. Az oldat ste- 10 riíezése G 5 üvegszűrőn történik. Az A-oldathoz a B-oldatot steril körülmények között hozzáöntjük, majd az oldat pH-értékét 5%-os, G 5 üvegszűrőn sterilezett NaHCOSi -ol- 15 dattal 7,2—7,4-re beállítjuk. Végül az oldatot steril üvegben, steril desztillált vízzel 10.000 mire feltöltjük. A tápfölyadékhoz használt laktalbumint foszfát-pufifero:Miatban feloldva 5%-os törzsoldatot 20 készítünk, amelyet aütoklávban sterilezünk, majd 0,5%-os hígításban alkalmazzuk. A tápfolyadékhoz használt savó borjúsavó esetében ktb. féléves, bikasavó esetén 1—IV2 éves állat sterilen vett és megalwadt véréből 25 kapott savó, amely literenként 0,2 g sztreptomicint és 50.000 E penicillint tartalmaz. A savót 30 ipercen át 56 C°-on inaktiváljuk. Baktériumakat és gombákat nem tartalmazó steril savót használunk. 30 Azt találtuk, hogy fenti tápfolyadékban a borjúvese sejttörzsek jól tenyészthetők és fenntarthatók, s így a külföldön használatos, nehezen hozzáférhető és import aminosavát és vitaminokat tartalmazó szintétiikus (Parker- vagy 35 Eagle-féle) tápfolyadékok nem szükségeseik. A primer tenyészeten kb. egy hét eltelte után összefüggő sajtbevonatot kapunk, eklkor elvégezzük az első átdltást. A sejtibevonatöt 1—2 csepp 0,:2%-os tripszin-aldattäl kezeljük, a 40 tripszán hatására V2—3/z óra alatt levált sejteket a tápfolyadékban szuszpendálva átoltjulk. A tovább Oltás dk során a , tripszin hatásaira levált sejteket nem különítjük el, hanem a tápfölyadéfcba történő pipettázással visszük Szusz- 45 penzióba. Az átoltásnál használt inokulum mennyisége irrándig az előző tenyészetnél használt sejtszuszipenzió mennyiségének kétszerese. A törzseket 38 C° hőmérsékletű termosztátban tartjuk. A sejtek átdltáísát 4—6 naponként vé- 50 gezzük. Ha átoltáskojr a fenti kis mennyiségű tripszint alkalmazzuk, akkor annak centrifugálással való eltávolítását elkerülhetjük, mivel a kis mennyiségű tripszdn a tápfolyadékban erősen felhígul. Ez nemcsak munkamegtakarítás szempontjából előnyös, hanem ezáltal a sejtekkel végzett manipuláció és ezzel a baktériumokkal vagy gombákkal való fertőződés veszélye is erősen csakken. A tenyésztéshez jénai vagy Sial minőségű üvegedényeket használunk. A tenyésztőedény 100 ml űrtartalmú lapos üvegpalack vagy 2 liter űrtartalmú Roux-palack. Az előbbibe 20— 25 ml, az utóbbiba 200 ml mennyiségű szuszpenziót mérünk. Az üvegedények tisztítása króimkénsavval történik, majd folyó- és desztillált vízzel végzett töibbszörös öblítés után azokat becsomagolva 160 C°-on száraz hővel 2 órán át sterilezzük. A ,labo,ratóriuim falait fertőtlenítőszerrel lemossuk és munka előtt a levegőt UV sugárzással fertőtlenítjük. A munkaasztalon steril box van elhelyezve, amely alatt külön UV lámpa ég. A tenyészetekkel dolgozók steril köpenyt és sebészi míaszlkot viselnek. Szabadalmi igénypont: Eljárás sejttörzsek kitenyésztésére, borjúembrióból vagy fiatal borjúból származó vese 0,2%-os tripszin-oldättal történő kezelésével Készített primer tenyészetből, steril munkakörülmények között, azzal jellemezve, hogy az összefüggő sejtbevonlat képződése után azt a tenyésztő edényben 1—2 csepp 0,2%^os tripszin-dldattal kezdjük, a tripszin hatásána %—3A óra alatt levált sejteket a tripszin elkülönítése nélkül 89,5% Hanfcs-Holdatot, 10% bika- vagy barjúsavót és 0,5% hidrolízált laktalbumint tartalmazó tápifolyadőklban szuszipendálvia átol'tjuk, mimellett az átoltásnál használt indkufan menynyisége az előző tenyészetnél alkalmazott sejtszuszpenzió ímennyiségének mindig a kétszerese, s a tenyésztés során a törzseket 38 C°-os termosztátban tartva a sejtek továbbdltását 4—6 naponként isimételjük. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója. 6908872. Zrínyi (T) Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21—23. 3
