156235. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
156235 21 22 legítés közben kevés etilacetátban oldjuk, majd viszonylag nagymennyiségű patroléter (1,8 g) hozzáadásával kicsapjuk. A vékonyréteges kromatogiraifálás alapján még szennyezett terméket tisztítás céljából etilaeetát-benzol-0,05 m 5 vizes ammómum-acetált oldat 2:1:2 arányú keverékében mindenkar 10 ml^es fázistér-fogatokkal Chnaig szerint multiiplikatív megosztásnak vetjük alá. 250 fokozat után a 45—74 megosztási elemekből (rmax = 60; K = 0,32) a tripep- 10 tid származékot akként izoláljuk, hogy az oldószert ledssztilláljuk, az ammóniumacetátot pedig 45 C°-on nagyvákuumban szublimáljuk. A végtermék kromatográfiai szempontból tiszta vegyület. Metanol-víz-elegyből történő átkris- 15 tályosítás után kapott kristályos termék olvadáspontja 180—182 C°. A szilikagél segítségével végzett vékonyrétegű kromatografálás során a következő R/-értékeket állapítottuk meg: 20 R/ (52) = 0,76 R/ (101) = 0,78 R/ (CHCla-metanol = 8:2) = 0,58 4. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OH. R/ (52) R/ (101) 5. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-OCHs 0,60 0,61. 3,09 g BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OH4; 5 ml vízmentes dimetilformamid és 15 ml acetonitril keverékében gyenge melegítés közben feloldjuk. Az oldatot 10 C°-ra lehűtjük, majd 15 ml acetonitrilben 1,23 g frissen készített norleucinmetilésztert adunk hozzá. Ezután a reakcióelegyhez még 2,04 g szilárd ditiklohexilkarbodiimidet adagolunk. Az oldatot egy óra hosszat 10 C°-on, majd 16 óra hosszat szobahőménsékleten keverjük. A feleslegben maradt diciklolhexilkaribodiimidet 1,4 ml etilacetát hozzáadása után szobahőmérsékleten 1 órás keveréssel elbontjuk. A kivált diciklohexilkarbamidot leszűrjük, a szűrletet 50 C° fürdőhőmérsékleten vákuumban szárazra pároljuk. A sárga olajos maradékot 200 ml etilacetátban oldjuk, az oldatot 70 ml n citromsavoldattal, 2 x 70 ml 2 n nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, végül 2 x 70 ml telített nátriumklorid oldattal extraháljuk, a kivonatot szilárd nátriumszulfát felett megszárítjuk és bepárol-25 685 mg BOC-D-Ser-Tyr-G,ly-OCH3 -ot 5 ml nátriumhidroxidban oldunk, 10 percig 20 C°on állni hagyunk, majd az oldatot 5 ml n sósavval semlegesítjük. A védett tripsptidet 50 30 ml vízzel telített n-butanollal extrahaljuk, a butanolos réteget 4—4 ml vízzel mossuk, majd kb. 3 ml-re bepároljuk. 30 ml petrolóter hozzáadása után kenőcsös csapadékot nyerünk, amelyeit etilaoetátból átkristály ásítunk. A termék 35 olvadáspontja 168 C° (bomlik). A termék vékonyréteges kromatografálás alapján egységesnek mutatkozik. A szilikagélben végzett R/ mérési értékek: 40 60 juk. A fehér színű, habos nyersterméket etilaoetát-petroléter-elegyből átkristályosíttjuk, majd 50 C°-on nagyvákuumban szárítjuk. A hozam 3,50 g, olvadáspont 138—142 C°. Üjbóli átkristályosítás után az olvadáspont 143—146 C°-ra emelhető. A tisztított termék szilikagélen végzett vékonyréteges kromatograifálása során az alábbi R/ értéket állapítottuk meg: R/ (benzoliaceton = 1:1) = 0,18 6. BQC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-NH-NH2 3,30 g BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-OMe-t 18 ml vízmentes etilalkoholban oldunk. A sárga színű, tiszta oldathoz 1,8 ml hidrazirihidirátot adunk és a gyengén zavaros oldatot 24 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kikristályosodott terméket leszűrjük, és a szűrőn hideg vízmentes etandllal mossuk. A szűredéket szobahőmérsékleten nagyvákuumban koncentrált kénsav felett szárítjuk. A hozam 1,4 g, olvadáspont 152—161 C° (bomlik). Az anyalúgból bepárlás, szűrés és szárítás után további 0,5 g terméket nyerhetünk ki, amelynek olvadáspontja 134,5—139 C° (bomlik). 1:1 arányú metanol-etanol-elegyből történő átkristályosítás után a termék olvadáspontja 172—177 C° (bomlik). A termék víztartalmú oldószerekből egy mól kristályvízzel kristályosodik. A kromatográfiai szempontból egységes termék R/-órtékei szilikagélen végzett vékonyrétegű kromatografálással a következők: R/ (kloroform-metanol = 1:1) = 0,64 R/ (kloroform-metanol = 8:2) = 0,28 7. BOC-D-Ser-Tyr-Gly^Nle-Glu (OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH 1,14 g (2 mmól) BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Nle-45 -NHNH 2 -t 10 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, majd keverés közben —15 C°-on 4 ml 2 n etilaceitátos sósavoldatot, majd 0,23 g (2,2 mmól) tercnbutinitritet adunlk hozzá. Az oldatot még 10 percig —15 C°-on keverjük, végül 1 50 ml trietilamin hozzáadásával gyengén lúgos kémhatásra állítjuk be. Az így kapott BOC-tetrapeptidHazidJoldatát 1,42 g (1,6 mmól) H-Glu(OtBu)^His-Phe-Arig-Try-Gly-OH 30 ml dimetilformamidban és 1,5 ml vízben képzett, és 55 —10 C°-ra lehűtött oldatához csepegtetjük. A reakciókeveréket 22 óra hosszat 0 C°-on keverjük, ezután 100 ml vizet adunk hozzá, a kivált amorfterméket lenuccsoljulk, 1:5 arányú dimetilformamid-víz-eleggyel és aoetonitrillel bontjuk, végül megszárítjuk. A szárított terméket vizes acetonitrilből történő kicsapással tisztítjuk. A légnedves 1,44 g (89%) tiszta BOC-dakapeptidtetrahidrát olvadáspontja 235—240 C° [a]20 D = = —22° (c = 1,1:1 arányú piridin-víz-elegy-65 ben). 11
