156157. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikofenolsav előállítására
156157 6 A nyomelem-koncentrátum összetétele a következő : FeS04 • 7H2 0 CuS04 • 5H2 0 ZnS04 MnS04 • 4H2 0 K2 Mo0 4 Desztillált vízzel 1,0 g 0,15 g 1,0 g 0,1 g 0,1 g 1 literre feltöltve Az oldat néhány csepp tömény sósav hozzáadásakor kitisztul. A fenti táptalajból 5 litert fermentorban, 25 C°-os hőmérsékleten 712 fordulat/perc keverés és 0,5 térfog at/tér fogat/perc levegőztetési arány mellett a Penicillium stoloniferum törzs (l.C.I. ACC. 438, ill. I.M.I. 126540 számú törzs) spóráival beoltunk. 93 óra múlva 65 ml 80 súly/tf%os glukóz-oldatot adunk hozzá. A fermentléből a micéliumot 215 óra múlva kiszűrjük. 1 liter szűrlet pH-ját tömény sósavval 2^re beállítjuk, majd etilacetáttal extraháljuk. Az első extrakciónál 200 ml, míg a 2. és 3. extrakciónál 100— 100 ml oldószert alkalmazunk. Az egyesített etilacetátos extraktokat vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk és a nátriumszulfátot kiszűrjük. Az etilaoetátos oldatot vákuumban szárazra pároljuk, majd a kapott halványbarna szilárd anyagot (2,5 g) 5 g aktívszén jelenlétében 100 ml etilacetátban oldjuk. Az elegyet 10 percen át visszafolyató hűtő alkalmazása mellett forraljuk, majd a szenet szűréssel eltávolítjuk. A forró szűrlethez keverés közben lassan 500 ml híg sósavat (vízzel 4 tf%-ra hígított tömény sósav) adunk és az elegyet a kristályok kiválásának befejeződéséig állni hagyjuk. Az elegyet ezután leszűrjük, a kristályokat előbb híg sósavval, majd petroléterrel (fp.: 40—60 C°) mossuk. A kristályokat végül vákuumban szárítjuk. 190 mg 139 C°-on olvadó tűkrisitályokat kapunk, melyek 95,4%, mikofenolsavat tartalmaznak (a meghatározást metanolos oldatban végeztük el, abszorpció 304 imt-nál). 2. példa: 32 mg mikofenolsavat 5 ml vízben szuszpendálunk és 10 ml 0,02 N nátriumhidroxid oldatot adunk hozzá. Az oldódást megfelelő mennyiségű etanol hozzáadásával teljessé tesszük ós az oldatot vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 10 ml etanolban szuszpendáljuk és az oldószert vákuumban 50 C°-on ledesztilláljuk. Az etanolos szuszpendálást, majd az oldószer ledesztillálását megismételjük. A szilárd termiéket forró etanollal történő mosás után szárítjuk. A kapott mikofenolsav-dinátriumsó 209—212 C°-on olvad. 3. példa: 57 mg mikofenolsav 5 ml éterrel képezett oldatához a halványsárga szín megmaradásáig éteres diazometán oldatot adunk. Az oldószert vákuumban kb. 20 C°-on ledesztilláljuk. A maradékot 25 ml kloroformban oldjuk és az oldatot vizes nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk. A kloroformos oldatot vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, majd az oldószert vákuumban kb. 20 C°-os hőmérsékleten ledesztilláljuk. A visszamaradó olajat vizes etanolból kristályosítva 104—105 C°-on olvadó mikofenolsav-metilésztert kapunk. !0 4. példa: 1137,5 literes fermentorba 655 liter alábbi összetételű táptalajt mérünk be: 15 Glukóz NH4 N0 3 KH2 P0 4 MgS04 -H 2 0 Élesztőextrakt 2Q Nyomelem-koncentrátum 40 60 65 12 súly/térfogat% 0,52 súly/térfogiat% 0,5 súry/térfog:at% 0,056 súly/térfogat% 0,1 súly/térfogat % 0,2 térfogat% A táptalajt a Penicillium stoloniferum törzs (l.C.I. ACC 438, ill. I.M.I. 126540 számú törzs) 25 fejlődő tenyészetével (728 liter) beoltjuk, majd 23 C°-on inkuibáljuk, 200 fordulat/perc mellett keverjük és 25,470 liter/óra levegőztetést alkalmazunk. A mikafenolsav-termielést spektrofotofluorimetrikus vizsgálattal mérjük (lásd 6. pél-30 da). A mikofenolsav koncentrációja 99 óra múlva 1114 mg/liter értékre emelkedik, ezután a ferment or tartalmát feldolgozzuk. 35 5. példa: A magnézium jelentős és specifikus szerepének bizonyítása céljából rázott lombikban az alábbi kísérletet hajtjuk végre: Táptalaj: Glukóz Ammónáumtartarát 45 KH 2 P0 4 Ny omelem-koncentrátum (lásd: 1. példa) 10 súly/térfogat% 0,427 sú'ly/térfogat% 0,5 súly/térfogat% 0,2 térfogat% 500 ml-nes lombikokban a fenti táptalaj alikvot 50 részeihez (100 ml) az alábbi táblázatban megadott értékek szerint különböző mennyiségben magnézium-, kalcium-, stroncium- vagy bárium-sókat adunk. Sterilizálás után mindegyik alikvotból 3 mintát a Penicillium stoloniferum törzs 55 (l.C.I. ACC 438, ill. I.M.I. 126540 sz. törzs) spóráival beoltunk és a tenyésztést az alábbi körülmények között végezzük el: Hőmérséklet: Keverés: Rázógép kilengése: 25 C° 200 fordulat/perc 5 cm Az egyes lombikokban levő termék meghatározását a 6. példában ismertetett módszerrel végezzük el azzal a változtatással, hogy a meg-3
