156139. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kandicidin előállítására mikrobiológiai úton
5 156139 6 erősen termolabilis, a n-butanolos extraktumokat alacsony hőmérsékleten kell bepárolni, ennek üzemi méretű megvalósítása vákuumban történő bepárlás esetében is nagyon komoly problémákat vet fel. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi butanolnál alacsonyabb forráspontú oldószerek vagy oldószer el egyek, pl. aceton vagy metanol-klorofoirm elegy használatát extrakciós célra, így az extraktum bepárlása jóval kíméletesebb, mint az Actinomyces griseus törzs butanolos extrafcciója esetén. Ezen túlmenően a találmány szerinti eljárás tisztább és nagyobb biológiai aktivitású végtermékhez vezet. A habzásgátlókánt használt zsírjellegű anyagok az aoetanos extraktumok feldolgozása közben zavarnak, mert a bepárlásnál '(semleges közegben) erős babzást okoznak, a bepárlást követő savanyítás után pedig az antibiotikummal együtt kiválnak a bepárolt extráktumből. A nyert antibiotikum így rendkívül nehezen szűrhető, kenőcs^kanziisztenciájú, és szűrés után az acetonos mosásnál a zsírjellegű anyagok az antibiotikumnak a mosó acetonban való feloldódását segítik elő. (Kísérleteink során azt a meglepő észlelést tettük, hogy az acetonos vizes extraktumból savas pfí-n petroléterrel kivonhatók a habzásgátlóként adagolt zsírjellegű anyagok. A petroléterrel kezelt acetonos 'extraktum könnyen bepátrolíható. Így a savanyítás után kivált antibiotikum jól szűrhető, és acetonos mosása nem jár jelentős antibiotikum-veszteséggel. A fermentáció' közben adagolt zsírjellegű hahzásgátlót a miicélium acetonos extraktumából bepárlás előtt petroléteres extraktióval célszerű eltávolítani, 4—5-ös pH-érték mellett. Az antibiotikumot a S. griseoríuber fermentátumból izolálva sárga, amorf port kapunk. Az antibiotikum hidroMzis-termékeiben kimutatható a p-aminoacetofénon és a mikozamin. Ultraibolya elnyelési színképének maximumai 340, 360, 380 és 402 m/t-nál vannak metanolban, megegyezően a kandieidin izolálására leírt értékekkel (Waksmian—Dechevalier: „The Actinomyceites", Vol. III. p. 225, Baltimore, 1962). ÍPapírkroimato^réfiás vizsgálataink során számos oldószerrendszerben az 8^502 jelű Streptomyees törzs fermentátumából izolált .antibiotikum és az autentikus kandieidin (Internat. Center of Information on Antibiotics által küldött minta) teljesen azonos R/-értékeket adott a heptaén antibiotikumok azonosítására legjobban bevált metanol : ammónia : víz rendszerben (20 : '1 : 4), ahol mindkét antibiotikum R/-értéke 0,44; 0,616. Papírkromatográfiás vizsgálatainkon kívül az S-502 jelű Streptoniyees törzs fermentátumából kinyert antibiotikumot ellenáramú megoszlásos módszerrel is. összehasonlítottuk kandicidiinnel i(E. BorowSíky és munkatársai, Antimicrobial Agents Annual, 19:60, 532. oldal). 200 csöves Liquofix-rendszerű automata készülékkel dolgoztunk. Az alkalmazott oldoszer^rendszer kloroform, metanol és 8,35 pH-jú borátpuffer 2:2:1 arányú elegye volt. Minden egyes kísérlethez 1 g anyagot használtunk. A megoszlási idő 4,15 perc volt. 200 megoszlás után mind a kandieidin, mind az S-ő'02, jelű antibiotikum aktív komponensének a maximuma a 110. csőnél volt. A csúcsfrakciókat izolálva ismét ellenáramú megoszlást •alkalmaztunk, recirkulációs technikával (E. Borowsky és mtsai, Chemother. 10, 176 [il965/66]). 300 lépéses recirkulációs ellenáramú megoszlás után a fentebb említett oldószeiMrendszerben mindkét anyag a 165. csőinél adott maximumot. Kísérleteink alapján megállapítottuk, hogy az ,c S-502-vel jelzett Streptomyces griseoruber törzs által termiéit antibiotikum azonos a kandicidinnel. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük. 20 1. példa: Az Actinomyces griseoruber burgonyakivonat-glükóiz-agaron a szokásos módszerrel termelt 25 spóra-szuszpenziójával beoltottunk 5 db 500 mles Erlenmeyer-loimbikot, amelyek 1001 ml alábbi összetételű vizes táptalajt tartalmaztak: 2 % amerikai mogyoróliszt (zsírmentes), 30 3 % glükóz, 0,5% kuknriealekvár, 0,1% tripszinnel emésztett kaziein, 0,3% NaCl, 0,5% GaOOs . 35 A pH sterilezés előtt 7,0. A táptalajt 20 percen át 121 C°-on sterileztük. A rázott kultúrákat 48 órán át tenyésztettük 28 C°-on síkrázógépen, és 40 liter hasznos térfogatú kísérleti üzemi fermentorokat oltottunk velük, amelyek-40 ben a táptalaj összetétele a következő volt: 2 % amerikai mogyoróliszt (zsírmentes), 5 % glükóz, 0,15%, kukoricalekvár, 45 0,2% tripszinnel emésztett kazein, 0,3% NaCl, 0,5% OaOOa, 91,5% víz. 50 A pH sterilezés alatt 7,0. A táptalajt 30 percen át l'2íl C°-on sterileztük. A fentiekben lebírt inokulummal oltottuk a táptalajt, és 28 C°on tenyésztettük a szokásos módon, keverés közben. A tenyészetet percenként 40 liter leve-55 gővel levegőztettük. A fermentátum a 72. órában 600 y/ml antibiotikumot tartalmazott. (A meghatározást a jellemző ultraibolya elnyelés alapján végeztük.) A fermentátum habaásakor pálmaolajat, orsóolajat vagy tributil-foszfátot 60 adagoltunk habzásgátlóiként. Az összes beadagolt olaj mennyisége 0,5—2 liter között változott fermentációnként. 100 liter erje&ztéses oldatból (amelynek aktivitása 0,6 g/liter és pH-ját 4,5-re állítottuk 65 oxálsav-O'ldattal) leszűrt 8 kg nedves micéliu-3
