155880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív polipeptidek és intermedierek szintézisére
29 3. lépés Z-Val-Lys(B0C)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu<)2 2,5 g (3,6 mmól) védett tetrapeptid észtert 28 ml 80%-os ecetsavban oldva csontszenes palládium jelenlétében a széndioxid-fejlődés megszűnéséig hidrogénezzük. Az oldatot szűrjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és a maradékot 20 ml vízben oldjuk. A vizes oldatot nátriumkar'bonáttal pH 9-re lúgosítjuk és a kiváló tetrapeptid-észtert háromszor .20 ml éterrel kirázzuk. Az egyesített éteres oldatok bepárlása után 1,8 g olajat kapunk (90%). Ezt 2,2 g (2,2 mmól) védett pentapeptid hidroxiszukcinimíd észterrel (10. példa 10. lépés) együtt 25 ml vízmentes dioxánban oldjuk kétnapi állás után vákuumban bepároljuk és a maradékot 50 ml etilacetátban oldva kétszer 10 ml 10%-os citromsav-, kétszer 10 ml 8%-os NaHC03 oldattal kirázzuk. Na2 S0 4 -os szárítás után az etilacetátot ledesztilláljuk és a maradékot petroléterrel szűrőre visszük. Így 3,15 g (100%) védett nonapeptidet nyerünk. Op.: 140°, (115°-on lágyul). Etüaceíát-petroléterből átcsapva. Op.: 132'—146°; R/3 0,72. CraHiMNioOu (1435,73). számított: C: 61,0%; H: 8,0%; N: 9,8% talált: 60,4 8,2 10,2 4. lépés H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu0-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu<)2 3,1 g (2,35 mmól) védett nonapeptidésztert 60 ml 80%-os ecetsavban oldva csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezünk. A széndioxid-fejlődés megszűnése után az oldatot szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 50 ml etilacetátban oldjuk négyszer 10 ml 8%-os N,aHC03 oldattal és 10 ml 10%-es Na 2 C0 3 oldattal mossuk, Na2 S0 4 -on szárítjuk és bepároljuk. A maradék petroléter alatt megszilárdul. Szűrjük, 1,7 g (61%) szabad nonapeptidésztert kapunk. Op.: 101—112°. (93°-on lágyul); R/3 0,15. 5. lépés Z-Lys(B0C)-Lys(BOC)-Arg(NO2 )-Arg(NO,)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-"' -Asp(OBuO-Ala-Gly-Glu(OBu')a 1,6 g (1,23 mmól) nonapeptidésztert és 1.66 g (1,23 mmól) védett pentapeptid pentaklórfenilésztert (7. példa 3/b lépés). 2 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot egynapos állás után vízmentes éterrel hígítjuk és a kiváló terméket szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk 2,65 g (90%) védett tetradekapeptidésztert kapunk, R/3 0,55. 30 6. lépés H-Lys:(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu0-Pro-Asp(OBu')-Ala-5 -Gly-GluíOBuOaS-HCl 2,65 g (1,21 mmól) védett tetradekapeptidésztart 150 ml ecetsavban oldva csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezünk. A reakció 1° előrehaladását vékony réteg kromatográfiával ellenőrizzük. A reakció befejeződése után az oldatot szűrjük, bepároljuk és a maradékot éterrel elporítjuk, szűrjük, szárítjuk (2,25 g). A nyers terméket 60 ml vízben oldjuk és jeges hűtés 15 mellett 7,8 ml 0,5 N sósavval az oldatot pH 4-re savanyítjuk 10 ml telített NaCl oldat hatására a tetradekapeptidészter triklórhidrát kiválik, szűrjük telített NaCl oldattal mossuk, szárítjuk (1,45/g). A NaCl tartalmú terméket 20 ml eta-20 nolban oldjuk 20 ml kloroformot adunk hozzá és a kicsapódó NaCl-ot kiszűrjük. Az oldat bepárlása után 1,35 g (53%) terméket kapunk R/1 0,35. 25 7. lépés BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu0-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-30 -Tyr(Bu0-Pro-Asp(OBu0-Ala-Gly-Glu<(OBu')2 3-HCOOH 0,60 g (0,305 mmól) védett tetradekapeptidet (1. példa 10. lépés) 0,69 g (0,305 mmól) tetra-35 dekapeptidészter triklórhidrátot, (11. példa, 6. lépés) 0,48 g (1,8 mmól) pentaklórphenolt 2,0 ml dimetilformamidban oldunk 0,124 g (0,6 mmól) diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és szobahőn állni hagyjuk. Másnap 1,5 ml dimetilformamidban oldott 0,3 ml (0,215 mmól) trimetilaminnal semlegesítjük a reakcióelegyet. További egy napot állni hagyjuk, majd peroxidmentes éterrel hígítjuk. A kiváló anyagot szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk 1,45 g védett oktakoza-4 peptidet nyerünk, melyet 50 g szilikagélből készült 2 cm átmérőjű oszlopon, etilacetát rpíridin: :hangyasav :víz = 60 : 20 : 6 : 5;5 arányú elegygyel kromatografáljuk. 20 percenként 3 ml-es frakciókat gyűjtünk. A tiszta, védett oktakozapeptid a 79—110-es frakciók bepárlásával volt nyerhető. 0,171 g (13%), R/1 0,30. 8. lépés 55 H~Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu—OH (humán ACTH 1—28) fin 171 mg védett oktakozapeptidet 5 ml 90%-os trifluorecetsavban oldunk, 15 perces állás után bepároljuk. A maradékot 2 ml vízben oldjuk és újra bepároljuk. Miután a vizes oldást és bé. párlást mégegyszer megismételtük, a maradékot 2 ml vízben oldva 5 ml acetátcikrusú Am-15
