155643. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hipoallergén penicillin-származékok előállítására

5 rülmények között dializálunk egy száraz állapotban 5 A, nedves állapotban 15—20 Á pórusméretű cellulóz diafragmán keresztül. A diafragmán át nem menő anyagot steril körülmények között kinyerjük és kimerítő dialízisnek vetjük alá; ilymódon egy 115 mg mennyiségű frakciót kapunk. Ez a nem dializálható frakció nagymolekulasúlyú fehérje jellegű anyagokból áll, amelyekhez nagyszámú penicilloil csoport kötődik. Az ultracentrifugálási módszerrel többszöri kísérletben meghatározott átlagos molekulasúly 3170 volt, ami arra mutat, hogy némi jóval nagyobb molekulasúlyú anyag is van jelen. Ezt az anyagot 6 n sósavval hat óra hosszat forralva savas hidrolízisnek vetettük alá, majd kétdimenziós papírkromatográfiával elemeztük a hidrolízisterméket és így nagyszámú aminosav jelenlétét állapíthattuk meg. A következő aminosavak jelenléte volt kimutatható: aszparaginsav treonin szerin glicin alanin valin és penicillamin (az adott kísérleti körülmények között ezek nem különültek el) metionin izoleucin leucin fenilalanin lizin cisztin. Egy másik kereskedelmi minőségű G-penicillinkészítmény 500 g-jából 190 mg nagymolekulasúlyú frakciót nyertünk ki. E frakció 5 meg mennyisége hatásosnak bizonyult a nyúl-antiszérummal benzil-penicilloil bovin gamma-globulinra passzívan immunizált tengerimaiadon vizsgálva. 2. példa 50 g Sephadex LH20 készítményt 60 tf% aceton-víz eleggyel kevertünk, majd gyorsan gázmentesítettük és betöltöttük egy 46 cm hosszú, 2 cm átmérőjű oszlopba. Az oszlopon át 5 g nyers benzilpenicillin 10 ml 60 tf%-os aceton-víz elegygyel készített oldatát vezettük, majd ugyanezzel az oldószereleggyel eluáltunk. Kb. 1,7 ml térfogatú frakciókat fogtunk fel és 0,1 ml-nyi mintákban hidroxilaminnal meghatároztuk a benzilpenicillin-koncentrációt. A benzilpenicillint tartalmazó frakciókat egyesítettük és vákuumban betöményítettük. A benzilpenicillint száraz hideg acetonból átkristályosítottuk, Büchner-tölcséren szárítottuk, végül vákuumban, foszforpentoxid felett fejeztük be a szárítást. Hozam 3 g, az elméleti mennyiség 60%-a. E termék 2 g-ját azután egy Sephadex G25 molekuláris szűrővel töltött 100. cm-es oszlopon frakcionáltuk és a kapott frakciókat P.C.A. teszttel vizsgáltuk, megfelelő módon szenzitizált tengerimalacokon. 6 3. példa 100 g benzilpenicillint 200 ml vízben oldottunk és egy Sephadex G25 molekuláris szűrővel töltött, 10 cm átmérőjű, 122 cm magas oszlopon ve-5 zettük keresztül az oldatot 1 liter/óra sebességgel. A nagymolekulasúlyú anyag a penicillin előtt vándorolt lefelé az oszlopon. Ezt az anyagot elkülönítettük, kis térfogatra pároltuk be és P.C.A. teszttel vizsgáltuk; az anyag nagymértékben 10 aktívnak bizonyult az anti-penicilloil antiszérum intradermális injekciójával passzívan szenzitizált tengerimalacokon. Ezt a koncentrátumot azután további tisztítás céljából egy LKB ReCyChrom készülékben egy Sephadex G25 töltésű kisebb 15 méretű oszlopon vezettük keresztül. Az eluált anyagot ibolyántúli abszorpcióval vizsgálva azt találtuk, hogy az főként a penicillinnél jóval nagyobb molekulasúlyú anyagokat tartalmaz, bár penicillin és penicilloinsavak is jelen voltak. Az 20 összes nagyfokú antigén aktivitást mutató frakciók együttes súlya az eredeti penicillin súlyának mindössze 0,025%-a volt. A nagyméretű Sephadex oszlopról kapott penicillintartalmú frakciókat összegyűjtöttük és 25 metilizobutilketonos extrakcióval a penicillint elkülönítettük, majd a számított mennyiségű 25%os nátriumkarbonátoldattal vizes fázisba extraháltuk át, azután acetonnal lecsaptuk. Hozam: 62 g. 30 Az így tisztított G-penicillint P.C.A. teszt útján összehasonlítottuk az eredeti penicillin-kiindulóanyaggal és így az alábbi I. táblázatban öszszefoglalt eredményeket kaptuk: 35 I. táblázat A kék színeződés átmérője az antitest-reakció Penicillin helyein, mm 40 1/50 1/250 1/1250 1/6250 antitesthígítás esetén Eredeti benzilpenicillin 30+30+17 + 45 Sephadex-szel tisztított benzilpenicillin +— — — — A fenti adatok azt mutatják, hogy a nagymole-50 kulasúlyú anyagok kb. 99,9%-a eltávolításra került a fenti eljárás során. Egy másik kísérletben 6 kg benzilpenicillint vezettünk át 0.5 kg-os részletekben egy 10 cm átmérőjű és 182 cm magas oszlopon, amely Se-55 phadex G25 molekuláris szűrőanyaggal volt töltve. Az előfrakciót felfogtuk, betöményítettük és egy ugyancsak Sephadex G25 molekuláris szűrőanyaggal töltött kisebbméretű oszlopon vezettük át, hogy a penicillin nyomait is teljésen eltávo-60 lítjuk, majd a felfogott frakqiót betöményítettük és fagyasztva szárítottuk; üymódon 160 mg fehérje-jellegű anyagot kaptunk. Egy további kísérletben 120 g ipari minőségű benzilpenicillin-káliumsót oldottunk 600 ml gáz-65 talanított, sterilre szűrt, pirogénmentes vízben 3