155243. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás 9-(béta-D-arabinofuranozil)-adenin termelésére

155243 9 10 módon valósíthatjuk meg. A keveréshez használhatunk turbinákat, lapátokat, lapátkerekeket vagy másféle mechanikus mozgató berendezéseket; lehet magát a fermentort mozgatni, forgatni vagy rázatni, aikalmazlhatunk különféle 5 szivattyúkat, vagy pedig levegőt vagy oxigént vezetünk át a fermentációs közegen. A levegőztetést úgy végezhetjük, hogy a fermentációs elegybe levegőt vagy oxigént fúvatunk be éspedig nyitott csöveken vagy perforált csöveken 10 keresztül, vagy olyan <csöveken át, melyek egy porózus diffúziós szakaszt tartalmaznak. Megvalósítható a levegőztetés a táptalaj oxigéntartalmú atmoszférában vagy ilyenen keresztül történő bepermetezésével, befecskendezésével 15 vagy beöntésével is. Az előnyös szubmerz tenyésztési módszerhez képest egy eljárás változat a felületi tenyésztési módszer a 9^(yS-iD-arabmofuranozil)-adenin előállítására. E szerint a vékony rétegben (rendé- 20 sen nem több mint 2 cm) levő steril vizes tenyésztáptalajt beoltjuk a Streptomyces antibiotieus 9-)(/?-D-arabinofuranozil)-adenint termelő törzsével és a beoltott elegyet aerob körülmények között inkübáljuk kb. 20 C° és 45 C° 25 közötti hőmérsékleten. A terméket azután a szubmerz tenyésztési módszerrel kapcsolatban leírt módon kapjuk meg. Miután az eljárás fermentációs szakaszát teljessé tettük, a kívánt terméket többféle mód- 30 szerrel kaphatjuk meg. Szubmerz tenyésztési módszer alkalmazása esetén az előnyös eljárás a következő: A micéliumot pl. szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük. A szűrési lepényt (,,nuccstortát") vízzel alaposan mossuk, a mosó- 35 vizeket egyesítjük a szűrt fermentlével és az egyesített oldatot csökkentett nyomáson betöményítjük, kb. az eredeti térfogatnak 1/12-ed részére. A betöményített oldatot hosszabb időn át i(ez néhány órától néhány napig terjed a 40 térfogattól függően) ,kb. 5 C°-ra lehűtve tartjuk és a kivált anyagot diatoma-föld segítségével szűréssel elkülönítjük. A szűrési lepényt ezután forró vízzel alaposan kiextralháljuk és az egyesített kivonatokat kb. 5 C°-ra hűtjük, amíg 45 a kiválás teljessé válik. A kivált kristályos 9-(/?-D-arabinofuranozil)-adenint szűréssel elkülönítjük és forró vízből történő egymást követő kristályosításokkal tovább tisztítjuk. Egy másik eljárásváltozat szerint a szubmerz RO tenyészetből a kívánt anyagot adszorbciós eljárás alkalmazásával is kinyerhetjük a következő módszerrel: Miután a fermentáció teljiessé vált, a imioéliumot ugyancsak szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük. A nyers terméket 55 azután oly módon adszorbeáltatjuk, hogy a szűrt fermentlevet aktív szénnel vagy más adszorbenssel kezeljük. Az adszorbciót szakaszosan vagy adszorbciós oszlopon történő folytonos áramoltatással valósíthatjuk meg. Az előnyös 60 szakaszos módszer szerint '0,1—0,6 súly/térfogat%, — előnyösen 0,35—0,40 sűly/térfogat% — aktív szén adszorbenst adunk a szűrt fermentléhez és a kapott szuszpenziót 1—3 órán keresztül keverjük. Bizonyos esetekben kívánatos- 65 lehet a szennyezések eltávolítása a szűrt fermentléből még az aktív szénnel történő kezelés előtt. Ez történhet úgy, hogy a fermentlevet vele nem elegyedő szerves oldószerrel, mint pl. etiléndikloriddal vagy etilacetáttal extraháljuk, vagy valamilyen nátrium-fázisban levő szintetikus kationcserélő-gyantával kezeljük. A nyers termék izolálására az aktív szén adszorbenst vizes acetonnal vagy valamilyen vizes rövidszénláncú alkanollal eluáljuk és az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott szilárd maradékot azután vízből vagy valamilyen rövidszénláncú alkanolból történő többszöri kristályosítással, vagy pedig a következő módszer segítségével tisztítjuk: A szilárd maradékot egy vízzel nem elegyedő folyékony alkanollal pl. n-butilalkohollal kivonatoljuk és a kivonatot felöntjük egy alumíniumoxiddal töltött oszlopra (pH = 5—6). Az alumíniumoxid-oszlopot 95-%-os vizes etanollal eluáljuk, az eluátumot bepároljuk és a kapott szilárd anyagot vízből vagy egy rövidszénláncú alkanolból kristályosítjuk, amikoris a kívánt .©^(/J-iD-arabinofuranozilJ-adeninhez jutunk. A találmány szerinti eljárás terméke, a 9-(/?-D-arabinofuranozil)~adenin, mint vírusellenes szer használható, 'minthogy az a herpes- és a vacciniavírus ellen in vitro és in vivo hatásos. A találmányt a következő példákkal magyarázzuk meg közelebbről: 1. példa: Hickey és Tresner szerint steril Streptomyces-spóráztató ferde agar táptalajokat készítünk [R. J. Hißkey és H. D. Tiresner, J. Bact, Vol. 64, 891—892 old. (19512)]. E táptalajok közül négyet beoltunk a iStreptomyces antibioticus NRRL 3238 liofilizált spóráival és 28 G°-on 7 napon át, vagy addig, amíg a légspórák növekedése jól halad, inkübáljuk, majd 5 C°-on tároljuk. A négy táptalajból származó spórákat felszuszpendáljuk 40 ml 0,1%-os steril nátrium-heptadecilszulfát oldatban. Tenyésztáptalajt készítünk, melynek összetétele a következő: Glukóz-monohidrát 2,0 % Oldószerrel extrahált szójababliszt (44% protein) 1,0 % Állati pepton (Wilson's Protopepton 159) 0,5 % Ammóniumklorid 0,2 % Nátriumklorid 0,5 % Kalciumkarbonát 0,215% Vízzel 100%-ra kiegészítve. A táptalaj pH-ját 10 n nátriumhidroxid oldattal 7,5 értékre állítjuk be. Ebből a táptalajból 12 litert beadagolunk egy 30 literes rozsdamentes acélból készült fermentorba. A táptalajt 90 percig 121 C°-ra hevítve sterilizáljuk, lehűlni hagyjuk, majd a fentiekben leírt 40 ml spóraszuszpenzióval beoltjuk és 25—27 C°-on 32 órán át inkübáljuk, mialatt 200 fordulat/perc sebességgel forgatjuk és per-