155100. lajstromszámú szabadalom • Eljárás virulens Propionibacterium oltóanyag előállítására
155100 10 15 20 MgCOs néküli szilárd és folyékony táptalaj a törzsfenntartásban 270% A találmányunk értelmében alkalmazott magnéziumkairbonát nem tartozik a szokásos pufferek közé. Az általában ismert pufferek kedvezőtlen biológiai befolyásuk miatt (toxicitás, hatásuk az anyagcserére, kis kapacitásuk) az inokulum készítésnél Propionibacteriumok esetében nem alkalmazhatók. A magnéziumkarbonát speciálisan „biológiai puffernak" mondható, amely a következőképpen működik: Az mokulumoldatba adagolt magnéziumkarbonát gyakorlatilag vízoldhatatlan, tehát csupán akkor megy oldatba, ha a biológiai folyamatok során keletkező szénsavval reakcióba lép az alábbi egyenlet értelmében : MgC03 + H 2 0 + C0 2 = Mg(HC0 3 ) 2 . A keletkező magnéziumhidrokarbonát a reakcióelegyben már oldódik és így a pufferhatás érvényesül. Amíg tehát az inokulum-elegyben hasznosítható szénhidrát metabolizálása folyik, a magnéziumkarbonát jelenléte biztosítja az optimális pH-t. Előnyösen 0,5—2% magnéziumkarbonátot tartalmazó táptalajon inkubálunk. Alkalmazhatunk azonban magnéziumkarbonát helyett „g ban ismertetjük, magnéziumoxidot vagy magnéziumhidrokarbonátot is. A puffer-rendszer működése lényegében a fentiekben ismertetett. A találmányunk értelmében alkalmazott magnéziumkarbonát elvileg a teljes fermentációs folyamathoz alkalmazható, ha ezt a gazdaságossági szempontok megengedik. Az alábbiakban azonban kimutatjuk, hogy a magnéziumkarbonát döntően miért alkalmazandó az vollétében inkubált, egyébként azonos törzset 2% glukóz tartalmú folyékony táptalajon 4 napos fermentáció után összehasonlítva, a keletkezett baktérium-tömeggel (sejtszám) egyenes arányban lévő nefelometriás mérések az alábbi eredményeket adták: MgC03 néküli szilárd és folyékony táptalaj a törzsfenntartásban 420% A nyert virulens oltóanyag a fentieken kívül további előnyökkel is rendelkezik. így megemlítendő, hogy a találmányunk értelmében előállított virulens oltóanyagot alkalmazva az előfermentáció tenyésztési ideje 40 órára csökken a korábbi 3—4 nappal szemben, az utófermentáció (főfermentáció) tenyésztési ideje pedig az 5,6-dimetilbenzimidazol beépülésével együtt 3,5—4,0% glukóz esetén 48 órára csökken, a korábbi 3—4 nappal szemben. Találmányunk további részleteit a példák-Példák : 30 1. A fermentációt a Propionibacterium shermanii 104/b jelzésű törzzsel folytatjuk le. A törzs előkészítése az oltáshoz a következő módon történik: A liofilizálva tartósított törzset vagy szelekció után, egy-sejttenyészetből nyert, szilárd táptalajon kifejlődött telepet inokulum előállításának szakaszában, illetve a „5 szilárd táptalajra oltjuk, s anaerob feltételek laboratóriumi oltóanyagkészítési műveletek s az üzemi inokulum előállítása folyamán. mellett, nitrogén atmoszférában 30 C°-on inkubáljuk 10—14 napig. A szilárd táptalaj öszszetétele: .. kukoricalekvár (sz.a/ glukóz NaH2 P0 4 MgC03 —Mg(HCO,) 2 agár 50 A kifejlődött tenyészetből 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 400 ml steril táptalajba oltunk, s 30 C°-on anaerob körülmények mellett 4—i6 napig inkubáljuk. A használt folyékony táptalaj összetétele: Ezért vázoljuk a fermentációs folyamatban az oltóanyag virulenciájának szerepét. Az oltóanyagok előállítása az általánosan alkalmazott gyakorlat szerint egy-sejttenyészetből indul ki, szilárd táptalajon (kb. 24 osztódási ciklus). A kifejlődött telepeket pl. Propionibacterium shermanii esetén 400 ml folyékony 45 pH: 7,4—7,6, NH 4 OH-dal állítva táptalajba átoltva 5-^6 nap alatt érünk el kb. 1010 /ml baktérium-számot. Ez a két tenyésztési művelet mintegy 40 (24 + 16) osztódási ciklusnak felel meg. Az ily módon nyert oltóanyagból 10 ml fagyasztott tenyészetet 2 1 folyékony táptalajba átoltva inkubálás után a teljesen kifejlődött tenyészetet 1,5 m3 -es készülékben lévő (1000 1) folyékony táptalajra oltjuk át. Ez az újabb két tenyésztési művelet kb. 16 (10 + 6) osztódási ciklusnak felel meg. 55 glukóz Ez után kezdődik a tulajdonképpeni vitamin- MgC03 termelés (elő- és utánfermentáció), mely alatt azonban már csupán 6—8 osztódási ciklus következik be. Az oltóanyag készítés során tehát 56 osztódási ciklus szerepel a továbbiakban bekövetkező 8^al szemben. A találmányunk értelmében előállított, virulens oltóanyag fokozott termelőképességgel rendelkezik, nagyobb a szaporodóképessége, így azonos módon, de magnéziumkarbonát tá-2,00% 1,25% 0,25% 0,50% 2,00% kukoricalekvár (sz.a.' (NH4 ) 2 S0 4 kalciumpantotenát pH: 6,8. 2,00% 0,30% 4,00% 1,00% 0,00.2% 60 A tenyészet 5—6 nap alatt éri el a legmagasabb baktériumszámot, (kb. 1010 /ml baktérium); a pH csak 5,8—'6,2-re csökken. A tenyészet ekkor alkalmas a továbboltásra. A továbbiakban kétféleképpen is eljárha-65 tünk: 2
