154996. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-tejsav előállítására fermentálással

5 154996 6 glukóz 30 g báktotripton 5 g élesztőkivonat 5 g anhildroszonbitol polioxietilén--monooleát 2 .. ml nátriumacetát, kristályos 10 g nátriumtiogliíkolát 0,05 g vasszulfát, hidrát 0,01 g mangánszulfát, hidrát 0,01 g ortofoszforsav, 85%-os 0,46 ml desztillált vízzel kiegészítve 950 ml-A pH-t 0,9 ml nátronlúggal (d = 1,33) 6,8-ra állítjuk be és 120 C°-on 25 percig sterilizálunk. Ezután a táptalajhoz 0,1 g L—(-f-)-«:isztein-hidrokloridot és 10 pg B12'-vitamint tartalmazó, szűréssel sterilizált 50 ml vizes oldatot adunk. Ezt elosztjuk 200 mm hosszú és 25 mm átmérőjű steril kémcsövek között kémcsövenként 20 ml-es adagokra, és minden kémcsőhöz száraz állapotban 180 C°-on másfél óra hosszat sterilizált 0,3 g kalciumkarbonátot adunk. A keverék pH-ja 6,3. A kémcsövekben levő táptalajt beoltjuk kémcsőben 37 C°-on ugyanilyen közegben állás közben kitenyésztett 0,8 ml Lactobacillus leichmanni (ATCC 4797) tenyészettel. 24 órai inkubálás után 37 C°Jon nyugalmi állapotban a tenyészet jól kifejlődik, nüre kémcsőben beoltjuk azonos táptalajba, amelynek 20 mi-éh ez hozzáadtuk 200 mg/l szpiramicinadipátnalk (azaz 173 mg/l szpiramicinnek) szűréssel sterilizált 0,(5 ml vizes oldatát. A táptalaj tehát 0,43 mg/l szpiramioint tartalmaz. 24 órai 37 C°on való inkubálás után a tenyészet kifejlődik, és átoltjuk azonos összetételű közegbe, amely azonban 0,43 mg/l helyett 1,73 mg/l szpiraimicint tartalmaz. Ezt 37' C°-on nyugalomban inkubáljuk. Az átoltásokat megismételjük azonos körülmények között egyre több szpi rami cint tartalmazó közegben, amely 4, 3, majd 8, 6, 13, 21,5, 30, 43, 60,5, 78, 104, 138, 173, 216 és végül 269 mg/l antibiotikumot tartalmaz. b) Inokuluim tenyészet készítése Egy 2 literes dugós ErJennieyer-]o.mbíkot megtoltunk a következő táptalajjal: pepton ammóniás élesztőkivonat anhidroszorfoitol polioxi-ettilén-monooleát nátriumacetát, kristályos nátriurwtioglikolát magnéziumszulfát, hidrát nátriumklorid vasszulfát, hidrát mangánszulfát, hidrát ortofoszforsav, 85%-°s desztillált vízzel kiegészítve tartalmazó, 20 percig 120 C°-on sterilizált 150 ml vizes oldatot és 15 mg L—(-H-cisztein-hidroklorid, 15 jiig B 12-Vitamin és 450 g szpiramicinadipát (azaz 388 mg szpir amicin) szűrés-5 sei sterilizált 75 rnl vizes oldaMt adjuk hozzá; végül előzőleg száraz állapotban -180 C°-on másfél óra hosszat sterilizált 45 g kalciumkarbonáttal egészítjük ki.. A keverék pH-ja 6,2. A beoltást 289 mig/1 szpiramicinnel szemben re-10 zisztens törzs 40 ml mennyiségű kémcsöves tenyészetével végezzük, és a lombikot bedugaszoljuk egy olyan gumidugóval, amelyen át vékony cső nyúlik a széndioxid eltávozására. Ezután 37 C°-on 30 óra hosszat rázóasztalon 15 (sebesség: 120 fordulat/perc, út 10 cm) inkubáljuk. 7,5 g 7,5 g 3 ml 15 g 0,075 g 0,3 g 0,015 S ) 0,015 S 0,015 g 0,69 ml 1275 ml-re 20 25 c) Termelő tenyészet Egy hengeres-kúpos 80 literes rozsdamentes acéltartályt elmozdítható fedéllel megtoltunk a következő összetételű táptalajjal: cukorrópamelasz 10 kg anhidroszorbitol polioxietilén--monooleát 50 onl vízvezetéki vízzel feltöltve 45 literre S0 A táptalaj pH-ját 2,5 ml kénsavval (d = 1,83) 7,0-ra állítjuk be, majd 15 percig, 100 C°-on tartjuk. 45 C°-ra való lehűtés után 5 g szpiramicinadipátot (azaz 4,3 g szpiramidnt) tartalmazó 300 ml nem steril vizes oldatot, majd 35 1,75 kg 50% szárazanyag tartalmú kukoricalekvárnak előzőleg 172 ml nátronlúggal (d = 1,33) 6,8 pH-;ra beállított és 60 percig 122 C°-on sterilizált 4 liternyi vizes oldatát adjuk. Végül kiegészítjük 3,25 kg sterilizálaitlan kalciumkar-40 bonáttal. A keverék (50 liter) pH-ja 7,1. A hőmérsékletet a táptalajba merülő rozsdamentes csőkígyóban keringő meleg vízzel 44 C°-on tartjuk. A táptalaja percenként 100 fordulatú lapátos keverővel keverjük. A beoltást 2 Erlen-45 meyer-lombikból származó 3 liter inokulum-tenyószettel végezzük. 60 órai inkubálás után a pH 5,5 lesz; a cefre 133 g Dntejsavat és 5 g glukóznak megfelelő maradék cukrot tartalmaz literenként. L-tejsav-dehidrogénázzal meg-50 állapíthatjuk, hogy a táptalaj legfeljebb 3 g/l L-tejsavat tartalmaz. d) A Dikalciumlaktát extrahálása 55 60 A fent leírt körülmények között előállított 17,4 liter erjesztett cefre pH-ját 5 g égetett mésznek megfelelő mésztejjel 6-ra állítjuk be. A közeget keverés közben 30 percig 80 C°-on tartjuk, majd 700 g szűréssegítőt adunk hozzá, és leszűrjük. A szűrőlepényt 5 1 80 C°-os vízzel mossuk. így 20 liter szűredéket kapunk literenként 94,2 g D-tejsavnak megfelelő kalciumlaktát alakjában. "A szűredéket pillanatbepárlóban vákuum-A pH-t 0,5 ml nátronlúggal (d == 1,33) 6, l-re állítjuk be, majd 45 percig 120 C°-»n sterilizáljuk a táptalajt. Lehűtés után 75 g glukózt 3