154935. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 28829 antibiotikum előállítására
5 154935 6 ammóniumsók és nitrátok. Szervetlen sókként pl. kloridok, karbonátok, szulfátok, nitrátok, foszfátok, mégpedig az alkáli- és földalkálifémek, továbbá a magnézium, cink, mangán és vas ilyen sói alkalmazhatók. A mikroorganizmus tenyésztésére aerob módon, pl. nyugvó felületi kultúrában, vagy pedig előnyösen alámerülő, levegő vagy oxigén jelenlétében rázópalackban vagy az ismert típusú fenmentorokban rázott vagy kevert kultúrában történhet. A tenyésztési hőmérséklet 27 C° és 37 C° között lehet. A tápközegben kfo. 2—5 nap múlva mutatkozik számottevő baktériumellenes aktivitás. A mikroorganizmus tenyésztését előnyösen több fokozatban folytatjuk le, vagyis először egy előkultúrát készítünk folyékony tápközegben, majd ezt pl. 1 : 20 arányban átoltjuk a tulajdonképpeni termelő tápközegbe. Az előkultúrát pl. oly módon állítjuk elő, hogy egy szilárd táptalajon kb. 14 napig inkubált spóra-micéliumot folyékony tápközegbe oltunk át, majd ott 48 óra hosszat fejlődni hagyjuk. A termelt antibiotikumnak a kultúrából, mégpedig a micéliumból való elkülönítése önmagukban ismert módszerekkel, az antibiotikum kémiai, fizikai és biológiai tulajdonságainak figyelembevételével történik. Az antibiotikus aktivitásnak az egyes elválasztási lépésekben, valamint magában a kultúrában való meghatározására kísérleti mikroorganizmusként jól alkalmazható a Botrytis cinerea. E mikroorganizmus hyphái az A 20829 antibiotikum hatására morfológiai változást szenivednek (erős elágazások képződnek egy bizonyos helytől kezdődően, úgy hogy boszorkányseprő (íblastomania) szerű alakulatok képződnek). A vizsgálatot pl. lemez-diffuziós módszerrel végezzük, az alább leírt módon: Maláta-ágár lemezek közepén egy 5 mm átmérőjű kerek felületet beoltunk Botrytis cinerea mikroorganizmussal, majd a lemezeket 24 C° hőmérsékleten 2—3 napig infcubáltatjuk. Ez idő alatt a micélium 20—30 mm átmérőjűre növekszik. A vizsgálandó anyag oldatát azután 6 mm átmérőjű szűrőpapír-karikák segítségével a micélium szélétől kb. 5 mm távolságra felvisszük. A lemezeket azután' további 24—36-óra hosszat inkubáltatjuk 24 C° hőmérsékleten. Aktív oldatok esetében a szűrőpapír-karikától számított 24 mm távolságig a hyphák morfológiai változása tapasztalható. Az A 28829 antibiotikum 30 gamma/ml koncentrációjú oldatai, még határozottan megállapítható hypha-változásokat idéznek elő. Az A 28829 antibiotikum az alábbi kémiai és fizikai tulajdonságokat mutatja: Ez az antibiotikum lipofil, semleges, színtelen kristályos anyag, amely többek között metanolban, etanolban, aeetonban, etilacetátban, kloroformban, éterben és petroléterben oldódik. Metanolból pálcácskák alakjában kristályosodik, amelyek 223—327 C°~on bomlás közben olvadnak. Az elemi analízis adatai: C = 60,53%, 60,79%, 60,97%; H = 8,25%, 8,76%, '8,52%; 5 N = 1,88%; B = 1,35%, l,180/0 ; O = 27,49% (számított érték). Az anyag termöelektromos módszerrel, me-10 tilénklorid oldószerben meghatározott molekulasúlya kb. 868. A káliumbromidban mért infravörös színkép többek között az alábbi értékeknél mutat sávokat: 3420, 2M6, 2880, 1735, 1630, 1515 (váll-15 képződés), 1465, 1370, 1328, 1287, 1263, 1222, 1202, 1178, 1127, 1100, 1070, 995, 923, 890, (vállképződés), 846, 795, 780, 757, 719 cm"1 (vö. 1. ábra). Az anyag mágneses magrezomancia-spektru-20 mát a 2. ábra szemlélteti. Az ibolyántúli abszorpciós színkép 210 és 400 millimikron között nem mutat maximumot. Szilikagélen, etilacetát vivőközeggel felvett vékonyrétegű kromatogrammon egyetlen folt 25 mutakozik, R/ = 0,75; a kimutatás tömény kénsavval való foepermetezés és 140 C° hőmérsékletre történő felihevítés útján vagy bioauto~ gráfiai módszerrel, spicaria mikroorganizmussal történhet. 30 Ha az antibiotikumot híg sósavval 30 percig hevítjük 100 C° hőmérsékleten, nem képződik ammonias ezüstnitráttal vagy anilinhidrogénftaláttal kimutatható redukáló cukor. Az A 28829 antibiotikum jó antibiotikus ak-35 tivitást mutat gram-pozitív mikroorganizmusok, mint Bacillus subtilis, valamint gombák, .mint Candida vulgaris, Faecilomyces varioti, Spicaria ellen. Az alábbi 2. táblázatban állítottuk össze az antibiotikum különböző koncemtrációk-40 ban e mikroorganizmusokkal szemben lemezdiffuziós módszerrel (az antibiotikum oldatával átitatott 6 mm átmérőjű szűrőpapír-karikákkal) meghatározott gátló hatását. A táblázatban a gátlási zóna átmérőjét adtuk meg, az egyes an-45 tibiotikum-koncentrációkra vonatkoztatva. 2. táblázat 50 55 60 Mikroorganizmus Zóna-átmérő az alábbi a biotikum koncentráció esetén 1 0,1 0,01 mg/ml mg/ml mg/ml 65 Bac. subtilis (természetes közegben) Bac subtilis (szintetikus közegben) Candida vulgaris Sacharomyces eerevisiae Paecilomyces varioti Spicaria sp. 22 mm 16 mm 11 mm 33 mm 18 mm 10 mm 10 mm 10 mm 28 mm 15 mm 9 mm 21 mm 18 mm 11 mm
