154387. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-halogén-7-dezoxi-lincomicin és 7-halogén-7-dezoxi-epilincomicin-származékok előállítására
13 154387 14 Glükóz-monohidrát 15 g Keményítő 40^ g Melasz 20* g Wilson-féle pepton Nr. 1591 10 g * A Wilson-féle pepton Nr. 159 egy állati eredetű enzimatikus úton lebontott fehérje-készítmény. Kukoricalekvár 20 g Kalciumkarbonát 8 g Lard oil 0,5 ml Csapvíz q.s. 1 1 A beoltáskor annyi DL-ethionint adunk a rendszerhez, hogy koncentrációja 2 mg/ml legyen. A lombikok tartalmát 4 napon át 2:8 C°-on Gump-féle körforgó rázóberendezésben fermentáljuk (fordulatszám = 250 ford./perc), majd azután „levágjuk". A fermentlé hatékonysága a későbbiekben ismertetett S. lutea-teszt szerint 200 mcg/ml, az összes szilárdanyag tartalom kb. 20 g/l. Tisztítás. A DL-ethioninos fermentációból származó fermentlét (235 1) a „levágás" pH-ján szűrjük, szükséges esetben valamilyen szűrési segédanyaggal. A micéliumpogácsát vízzel mossuk, majd a micéliumot kidobjuk. A szűrt oldatot és a mosóvizet (275 1) 45 percen át 12,5 kg aktív szénnel és 2,5 kg diatómafölddel keverjük. Az elegyet leszűrjük és a szűredéket csatornába engedjük. A kapott aktívszenes nuccslepényt előbb 60 1 vízzel mossuk és a mosóvizet csatornába engedjük, majd a mosást 70 1 20%-os vizes, acetonnal megismételjük és a vizes acetont is elengedjük. A nuccslepényt ezután kétízben egyenként 100 1 90°/(ro s vizes acetonnal eluálj<uk. Az eluátumokat egyesítjük (215 1), majd 18 1 térfogatra betöményítjük. A tömény acetonos oldatot 50%-os vizes nátriumhidroxid-oldattal pH = 10 értékre meglúgosítjuk, majd három ízben, egyenként 20—20 literes adagokban metilénkloriddal extraháljuk. A metilénkloridos kivonatokat (60 1) egyesítjük, majd betöményítjük. Így 7,14 g olajos terméket kapunk, amely egyenlő mennyiségben lincomicint és lincomicin C-t tartalmaz, szabad bázis formájában. A terméket 200 ml metilénkloridban oldjuk, az oldatot tisztítás céljából megszűrjük, majd vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 100 ml 1 n metanolos sósavban oldjuk. A metanolos oldatot 3,2 1 éterrel elegyítjük és keverjük. A nyers lincomicin hidrokloridot és lincomicin C-hidrokloridot színtelen kristályok formájában kapjuk, ezeket szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A kapott 7,14 g anyag Sarcina lutea tesztben 940 meg/mg hatékonyságúnak bizonyult. (A Sarcina lutea tesztet 7,0 pH-jú 0,1 mólos foszf átpuf ferrel pH = 6—8 értékűre beállított agar lemezen végezzük egységesen 0,08 ml oldattal 12,7 mm átmérőjű próba korongokat itatunk át, ezeket helyezzük el az agar-lemezen, mely a tesztmikróbával be van oltva.) A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat azt mutatja, hogy a lincomicin4iidroklorid és a lincomicin C-5 -hidroklorid megközelítően egyenlő mennyiségben van jelen a termékben. A nyers lincomicin C-hidrokloridot (7,0 g) 20 ml vízben és 20 ml butanolban oldjuk, a pH-t 10 In sósavval beállítjuk 4,2 értékre, majd az oldatot megfelelő berendezésben 1000 fokozatú ellenáramú megoszlatásnak vetjük alá. Vékonyrétegkromatográfiával kimutatható, hogy a 135— 190 számú frakciók tartalmazzák a lincomicin 15 C-t, ezeket a frakciókat egyesítjük, majd betöményítjük olyan mértékben, hogy még folyadékhalmazállapotú legyen, végül fagyasztva szárítjuk. így 2,44 g lincomicin C-hidrokloridot kapunk, amely a Sarcina lutea teszt szerint 1400 20 mcg/mg hatékonyságú. Ebből 500 mg-ot feloldunk 2 ml vízben, 1 ml metanolban és 100 ml acetonban. Az oldatot szűrjük, majd keverés közben étert adunk hozzá mindaddig, amíg kristályok kezdenek leválni. Ekkor az elegyet 25 szobahőmérsékleten egy órán keresztül állni hagyjuk, majd a lincomicin C-hidroklorid kocka alakú kristályairól a szupernatáns oldatot dekantáljuk és így a kristályos anyagot elkülönítjük. Ezt 1 ml víz, 1 ml metanol, 80 ml ace-30 ton és 20 ml éter elegyéből átkristályosítjuk, amikoris 250 mg kockakristályos lincomicin C-hidrokloridot kapunk. A szupernatáns folyadékot csakúgy, mint előbb, de 5 C°-on és 4 órán át állni hagyjuk. Ekkor tűkristályos lincomicin 35 C-hidroklorid válik ki, ezt szűrjük és szárítjuk. A kapott tűkristályos lincomicin C-hidroklorid súlya 150 mg, olvadáspontja: 151—157 C°. D) Lincomicin C előállítása más módszerrel. 40 8,85 g i(0,02 mól) linoomicin-hidrokloridot 20 ml vízben oldunk, majd 0 C°-ra lehűtve keverés közben cseppenként 3,52 g (0,022 mól) brómot adunk hozzá egy perc leforgása alatt. Ez-45 után 25 ml etántiolt adunk a reakcióelegyhez és 25 C°-on két órán keresztül keverjük. Tiszta,, színtelen kétfázisú rendszert kapunk, minthogy az etántiol vízben viszonylag igen rosszul oldódik, majd ezt jégfürdővel lehűtjük és mint-50 e §y 5 percig hidrogénklorid gázt buborékoltatunk bele. Az alul levő vizes fázis megvörösödik. A reakcióelegyet ezután három ízben, egyenként 100 ml-es adagokban Skellysolve B-vel extraháljuk, majd a vizes fázist nátriumhidroxid gg oldattal 11 pH-ra meglúgosítjuk és ezt kloroformmal kimerítően extraháljuk. Az egyesített kivonatokat telített nátriumklorid oldattal mossuk, szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. 6,2 g fehér szilárd anyagot kapunk, 60 melyből 4,(8 g-ot 800 g szilikagélen kromatografálunk, oldószerként metanol-kloroform (1 : 7) elegyet használva. 800 ml előzetes eluátum után 80 frakciót gyűjtünk össze, ezek térfogata egyenként 25 ml. A 40—58. frakciót egyesítjük és 65 szárazra pároljuk. A kapott szilárd maradékot 7
