154386. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-klór-7-dezoxilincomicin és 7-klór-7-dezoxi-epilincomicin származékok előállítására
13 154386 14 1 l-es háromnyakú lombikba 150 ml konc. sósavat és 50 ml előzetesen 0 C°-ra lehűtött etántiolt mérünk be, majd hozzáadunk 15 g lincomicin-hidrokloridot. Az anyagot ezután szobahőmérsékleten 5 órán keresztül mágneses keverővel keverjük, majd azonos térfogatú jeges vízzel hígítjuk és alaposan extraháljuk Skellysolve B-vel ((technikai hexán), majd ezeket az extraktumokat elöntj ük. A "sav nagyobb részét úgy semlegesítjük, hogy óvatosan szilárd káliumhi'droxidot adunk a reakcióelegyhez erős keverés közben, miközben a hőmérsékletet acetonos-szárazjeges hűtéssel 20— 30 C° között tartjuk. A szilárd káliumkloridot szűréssel eltávolítjuk és kloroformmal alaposan kimossuk. A szűredékhez további kloroform mennyiséget (kb. 150 ml-t) adunk és a reakcióelegyet mágneses keverővel keverve a pH = 10 érték eléréséig 2 n vizes nátriumhidroxid oldattal elegyítjük. A kloroformos réteget elválasztjuk, a vizes fázist kloroformmal kimerítően extraháljuk, majd az egyesített kivonatokat két ízben vízzel mossuk és vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk. Az oldószert 30 C°-on vákuumban eltávolítjuk és így félig szilárd maradékot kapunk, amely acetonból kristályosítva 5,41 g 6,8-didezoxi-8-!(transz-l-imetil-4-propil-L-2-pirrolidmkarboxamido)-D-eritro-D-galakto-aldehido-októz-dietilditioacetált eredményez színtelen lapos tűkristályok formájában, op.: 130—132 C°. Az anyalúg betöményítésével további 1,5 g anyagot kapunk, ennek olvadáspontja 129—131 C°. A teljes kitermelés 6,91 g, (42,4%). Analízis: C21 H 42 N 2 0 6 S 2 képlet alapján. Számított: C = 52,25%, H = 8,77%, N = 5.81%, S = 13,29%; Talált: C = 52,38%, H = 8,71%, N = 5,93%, S = 13,48%. B)2. Gyűrűzárási reakció lincomicin C előállítására. a) Egy rész a B)l. pont szerint előállított dietilditioacetált és í egy rész p-toluolszulfonsav,-monohidrátot 25 rész acetonitrillel addig forralunk visszafolyatás közben, amíg az anyag baktériumellenes hatásúvá válik. A reakcióelegyet lehűtjük és szárazra pároljuk, majd szilikagélen kromatografáljuk, etilacetát, aceton és víz 8:5:1 arányú elegye vei. A 102—131. frakció baktériumellenes hatást mutatott. Ezekből a 105—125. frakciót egyesítjük és szárazra pároljuk, majd sósavval megsavanyított acetonból kristályosítjuk. Az anyagot végül átkristályosítjuk oly módon, hogy vízben oldjuk és acetonnal kicsapjuk a lincomicin C hidrokloridját, a kristályok 149—153 C°-on olvadnak. b) A B)il. pont szerint előállított ditioacetált 260 C°-;ra hevítjük 3 percen át, mimellett etilmerkaptán keletkezik, amely szagáról felismerhető. A kapott anyagból a B)2. a) pontban leírt kromatográfiás tisztítással lincomicin C-t állíthatunk elő. C) Lincomicin C előállítása fermentációs úton. A lincomicin C hidrokloridját a következőképpen állítjuk elő. 5 Fermentáció Egy sorozat 500 ml-es Erlenmeyer lombikba a következő összetételű és előzetesen 7,3 pH-n ste-10 rilizált oltótáptalajiból 100 ml-es adagokat bemérünk, majd beoltjuk ferde táptalajon tenyésztett Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis NRRL 21936 törzzsel. 15 Yeastolac1 10 g Glükóz-monohidrát 10 g Z-Z-amine-BH, 5 g Csapvíz q. s. 11 20 I'A Yeastolac élesztősejtek hidrolizátuma. 11 Az N-Z-amine-B. Sheffield szerint enzimatikusan lebontott kazein. A mikroorganizmusokat 2 napon át 28 C°-on 25 Gump-féle körforgó rázóberendezésben 250 ford/perc fordulatszámmal tenyésztjük. A fent leírt tenyészetből 5%-ot (azaz 5 ml-t) adunk egy 30 darab" 500 ml-es Erlenmeyer lombikból álló sorozat minden egyes tagjához be-30 oltás céljából, a lombikok 100 ml fermentációs folyadékot tartalmaznak, melynek összetétele a következő: Glükóz-monohidrát 15 g Keményítő 40 g Melasz 20 g Wilson-féle pepton Nr. 1591 10 g Kukoricalekvár 20 g Kalciumkarbonát 8 g Lard oil 0,5 ml Csapvíz q. s. 1 1 iA Wilson-féle pepton Nr. 159 egy állati eredetű enzimatikus úton lebontott fehérje-ké-45 szítmény. A beoltáskor annyi DL-ethionint adunk a rendszerihez, hogy koncentrációja 2 mg/ml legyen. 50 A lombikok tartalmát 4 napon át 28 C°-on Gump-féle körforgó rázóberendezésben fermentáljuk (fordulatszám = 250 ford/perc), majd azután „levágjuk". A fermentlé hatékonysága 55 a későbbiekben ismertetett S. lutea-teszt szerint 200 mcg/ml, az összes szilárdanyag tartalom kb. 20 g/l. i Tisztítás 60 A DL-ethioninos fermentációból származó fermentlét (235 1) a „levágás" pH-ján szűrjük, szükséges esetben valamilyen szűrési segédanyaggal. A micéliumpogácsát vízzel mossuk, 65 majd a micéliumot kidobjuk. A szűrt oldatot
