154337. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidek tisztítással egybekötött betöményítésére

3 kiesapás esetében például háromszorosára növekszik az oldat térfogata. A végtermék szükséges töménységét hosszadalmas vákuumbepárlással és liofilezéssel érik el. E bonyolult eljárásokkal csak viszonylag kismértékű tisztulás érhető el. A találmány célja az ismert eljárások hátrányainak kiküszöbölésével olyan eljárás biztosítása, amely jó hozammal és könnyen megvalósítható módon teszi lehetővé nagy tisztaságú és koncentrációjú kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptid készítmények előállítását. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidek bizonyos koncentrációjú szulfoszalicilsavat és adott esetben rövidszénláncú alkoholt vagy ketont is tartalmazó vizes oldatból 15 C° alatti hőmérsékleten kicsaphatok, és így vízben jól oldódó csapadék nyerhető. Ez a felismerésünk azért meglepő, mert a fehérjementesítésre általánosan alkalmazott szulfoszalicilsavval kapcsolatban eddig az volt ismert, hogy az a kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptideket nem csapja ki (1 084 433 sz. és 1155 563 sz. NSzK szabadalmak). Felismerésünk azért is meglepő, mert vizsgálataink szerint más fehérje kicsapószerek, így triklórecetsav és perklórsav esetében ezek a polipeptidek a hőmérséklet csökkentésével nem csaphatók ki. Az 1 181 859 sz. NSzK szabadalom szerint például a fehérjementesítésre alkalmazott perklórsavat 4 C°-on távolítják el káliumsó formájában az aktív polipeptideket tartalmazó oldatból. Ezen a hőmérsékleten perklórsav jelenlétében nem csapódnak ki a kallikrein-inhibitor és tripszin-inihibitor hatású polipeptidek. A csersav, metafoszforsav és polifoszforsav esetében a kicsapás nem hőmérsékletcsökkenés hatására, hanem erősen savanyú közegben a kicsapószer nagy feleslegének hatására következik be, és a keletkező csapadék vízben nem oldódik, csak lúg-, só- vagy savoldatban. A találmány eljárás nagy tisztaságú és koncentrációjú kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptid-készítménv'ek előállítására tisztított állati szervkivonatokból, amely abban áll, hogy a fenti polipeptideket a tisztított állati szervkivonat fehérjementesítése után nyert vizes vagy adott esetben legfeljebb 30 4/Wo rövidszénláncú alkoholt vagy ketont is tartalmazó vizes oldatból 2—10 s/t% szulfoszalicilsav hozzáadásával, ill. jelenlétében 15 C° alatti, célszerűen 0 C° és —10 C° közötti hőmérsékleten kicsapjuk, a csapadékot elkülönítjük, vízben oldjuk, majd az oldatban levő szuMoszalicJlsav-nyomokat ismert módon eltávolítjuk. Az így kapott termék terápiás célra alkalmazható tisztaságú és töménységű. Megállapítottuk, hogy a kiváló polipeptidek mennyisége annál nagyobb, minél alacsonyabb hőmérsékletre hűtjük az oldatot. A kiválás már 15 C°-on megkezdődik, 0 C°-on kb. 80%-a válik ki az aktív polipeptideknek, míg —4 C°-on a kiválás már kvantitatív. Rövidszénláncú alkohol 4 vagy keton hozzáadásával az oldatot megfagyás nélkül 0 C° alá hűthetjük a kiválás teljessé tétele céljából. Amennyiben az aktív polipeptidek mellett 5 szennyezésként jelenlevő fehérjék eltávolítása szulfoszalicilsavval történt, a találmány esetében a fehérjementesítés után nincs szükség a szulfoszalicilsav feleslegének eltávolítására, sem pedig további vegyszer hozzáadására; az aktív 10 polipeptideket pusztán az oldat hőmérsékletének csökkentésével csapjuk ki. A találmány szerinti eljárás számos előnye közül az alábbiakat említjük meg. A szulfoszalieilsavas csapadék vízben igen jól 15 oldódik, ellentétben a metafoszforsavval, polifoszforsavval vagy csersavval kicsapott polipeptidekkel, melyek csak lúg-, só- vagy savoldatokban oldhatók; így a találmány esetében nincs szükség a csapadék oldása után az oldat térfo-20 gatának jelentős megnövekedését, vagyis az aktív polipeptidek felhígulását eredményező műveletekre. A csapadék jó vízoldékonysága lehetővé teszi, hogy tetszés szerinti töménységű oldatot készítsünk belőle; feleslegessé válik tehát 25 mind a hosszadalmas vákuumbepárlás, melynek során az aktív anyag egy része elbomlana, mind a liofilezés. Eljárásunk a polipeptidek nagymértékű tisztulását eredményezi, és rendkívül egyszerűen S0 keresztül vihető. További előnye, hogy amenynyiben a fehérjeszennyezések kicsapása szulfoszalicilsavval történt, a szulfoszalicilsav eltávolítása és további vegyszer hozzáadása nélkül, csupán a hőmérséklet csökkentésével teszi lehe-35 tővé az aktív polipeptidek kicsapását. A szulfoszalicilsav-tartalmú oldatból kivált csapadék csak nyomokban tartalmaz szulfoszalicilsavat, így ennek eltávolítása lényegesen egyszerűbb, mint a fehérjék kiesapásához használt szulfo-40 szalicilsav teljes mennyiségének eltávolítása. A kallikrein-inhibitor aktivitást (KIE) Werle— Kaufmann—Boetsch szerint [Hoppe Seyler's Z. f. physiol. Chem. 319, 52 (I960)], a tripszin-inhibitor aktivitást (TIE) pedig Anson szerint [J. Gen. 45 Physiol. 22, 79 (1939)] mértük. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: 50 • Marhatüdőből kivont, tisztított kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor tartalmú, 200 ml vizes oldathoz, amely 35 TIE- és 8 600 000 KIE-aktivitást tartalmaz 2,5 TIE/g fehérje tiszta-55 ságban, 20 ml 50%-os szulfoszalicilsav-oldatot adunk. A csapadékos oldatot 20 C°-on 2 órán át állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A felülúszó 31 TIE- és 8 100 000 KIE-akti vitást tartalmaz 4,8 TIE/g polipeptid tisztaságban. A szulfo-60 szalicilsavat, valamint a fehérjementesített kallikrein-inhibitort és tripszin-irihibitort tartalmazó oldatot 0 C°-on tartjuk másnapig, és a csapadékot ezen a hőmérsékleten szűréssel elkülönítjük. Az aktív polipeptideket tartalmazó csa-65 padékot 100 ml desztillált vízben oldjuk. Az ol-2