153833. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prothrombin kinyerésére vérplazmából
153833 Ezekhez az eljárásokhoz képest haladást jelentett a prothrombin bárium-szulfátos adszorpciója, mert egyfelől közvetlenül a vérplazmából foganatosítható, másfelől pedig ennek az adszorbensnek a prothrombinhoz való affinitása lényegesen nagyobb az előzőekben felsoroltakhoz képest. Dale és Walpole fél évszázadra viszszatekintő megfigyelése nyomán (Biochem. J. 10 (1916) 331] bárium-szulfátot használ a 872 536 sz. brit szabadalom, Goldstein és munkatársai [J. Biol. Chemistry 234 (1959) 2857], Khodorova és mtsa [Ukrain. Biokhim. Zhur. 28 (1956) 142], Rosenfield és mtsa [Arch. Biochem. Biophys. 16 (1948) 329], továbbá Belitser és munkatársa [Ukrain. Biokhim. Zhur. 33 (1961) 499]. A felsorolt szerzők az adszorbenst vagy finomra őrölt por, vagy pedig előre elkészített, standardizált és konzervált vizes szuszpenzió alakjában adják az alvadásban meggátolt vérplazmához. A találmány célja olyan eljárás biztosítása, amely kiküszöböli a korábbi eljárások hátrányait és a prothrombin előállítását egyszerű és könynyen kivitelezhető technológiával gazdaságosan teszi lehetővé. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy az emberi és állati vérplazmák prothrombinja közvetlenül, specifikusan és kvantitatíve megköthető oxalát-ionoknak bizonyos kétértékű kationokkal a vérplazmában képzett vízoldhatatlan sóival, majd ebből a kemoszorpciós kötésből felszabadítva kémiailag homogén formában nyerhető ki és így kiválóan alkalmas nagy aktivitású és a gyógyászatban is alkalmazható thrombin — készítmény előállítására. A találmány alapját képező felismerés nem volt előre látható, mert bár a prothrombin előállítására vonatkozó ismert eljárások túlnyomó részben adszorpciós módszerek, az alkalmasnak bizonyult adszorbensek a fémhidroxidok, a vér alvadóképességére élettani viszonyok között egyébként közömbös neutrális sók, a fehérjék adszorpciójára általánosan használt szervetlen vegyületek, továbbá cellulóz-származékok és módosított szerkezetű dextrán-molekulaszűrők közül kerültek ki. Másfelől pedig az eddig alkalmazott legkülönfélébb adszorbenseket kivétel nélkül előre elkészített formában hozták össze a prothrombint tartalmazó oldatokkal vagy a vérplazmával. így váratlan és meglepő, hogy a prothrombin a vér alvadékonyságát felfüggesztő oxalát-ionoknak bizonyos kétértékű kationokkal a vérplazmában képzett oldhatatlan sóival in statu nascendi megköthető és az egyéb plazmafehérjéktől ezáltal elkülöníthető. A találmány eljárás prothrombin előállítására az alvadásban oxalát-ionokkal meggátolt vérplazmából, amely abban áll, hogy a vérplazmához kétértékű kationok olyan vízoldékony sóit adjuk, amelyek az oxalát-ionokkal lCT3-nál kisebb oldhatósági szorzatú sót képeznek, az így létrehozott csapadékot az általa megkötött prothrombinnal együtt a plazmától elkülönítjük, majd ismert módon mossuk, a prothrombint a mosott csapadékról leoldjuk és oldatából izoláljuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös fo-10 15 20 25 ^0 35 40 45 50 55 60 65 ganatosítási módja szerint a vérplazma oxalát-ionkoncentrációját a 10~3 -nál kisebb oldhatósági szorzatú oxalátsó képzését megelőzően 0,05—0,20 mól/liter, célszerűen 0,06—0,16 mól/liter koncentráció-határok közé állítjuk be oxálsav és dinátrium-, vagy dikálium-oxalát alkalmazásával, majd a vérplazmához cink-, kadmium-, stroncium-, mangán-, vagy bárium-ionokat adagolunk, célszerűen 5—10%-os vizes klorid-, illetve nitrát-oldat alakjában. Az oxalát-ionokkal 10~3 nál kisebb oldhatósági szorzatú só képzését —5 — +24 C° közötti hőmérsékleten és pH 6,0—8,50 határértékek közt végezzük úgy, hogy a kationokat a plazmában levő oxalát-ionok kicsapásához szükséges vagy annál nagyobb koncentrációban adjuk a plazmához. A találmány szerinti eljárás értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a vérplazma oxalát-ionkoncentrációját 3%-os nátrium-oxalátoldat hozzáadásával 0,10 mól/liter töménységre állítjuk be, majd állandó keverés közben, vékony sugárban előnyösen bárium-klorid 10%-cs vizes oldatát adjuk hozzá olyan mennyiségben, hogy a vérplazma megnövelt oxalát-iontartalma teljes mennyiségében oldhatatlan oxalátsó vá alakuljon át. A kevertetést 10 C° hőmérsékleten 1 órán át folytatjuk, a plazma eredeti pH-jának megváltoztatása nélkül. Az így létrehozott oxalátsó a vérplazmában jól ülepszik s így attól a felületén megkötött prothrombinnal együtt centrifugálással jól elkülöníthető. Az adszorbens felületén nem kemoszorpciós kötésben levő szennyező plazmafehérjéket 0,05—0,10 mól/liter töménységű oxalát-iont tartalmazó neutrális sóoldattal, előnyösen 0,14—1,50 mólos konyhasóoldattal mossuk ki, ezek elkülönítése után pedig a prothrombint 0,05—0,50 mól/liter koncentrációjú trinátrium-citrát oldattal oldjuk le. A citrát-ionokat tartalmazó oldatából a prothrombint ismert módon, célszerűen acetonnal csapjuk ki, majd a citrát — prothrombin — csapadékból a citrát-ionok fölöslegét dialízissel távolítjuk el; a szerves oldószeres kicsapás megismétlése után a tiszta prothrombint szerves oldószerrel szárítjuk meg, vagy liofilizáljuk. A találmány szerinti eljárásnak az ismert eljárásokkal szemben előnye az, hogy a prothrombin megkötését közvetlenül, a vérplazmában létrehozott adszorbenssel in situ nascendi teszi lehetővé s így technológiailag rendkívül egyszerű, könnyen kivitelezhető és gazdaságosabb a korábbi módszereknél. 1. példa: 1 liter 2%o nátrium-oxalátot tartalmazó +10 C°-ra hűtött marhaplazmához ugyanilyen hőmérsékletű 750 ml 2%-os nátrium-oxalát oldatot adunk, majd állandó keverés közben 170 mi 10%-os bárium-klorid oldatot, vékony sugárban, állandó keverés közben. A keverést 60 perc múlva leállítjuk s ülepedés után a prothrombint megkötve tartalmazó báriumoxalát csapadékot centrifugálással különítjük el a plazmától. (A fölöttes plazmában Quick módszere szerint mért ?
