153831. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1,4-dién-3,17-dion-szerkezetű szteroidok mikrobiológiai előállítására

153831 Ennek igazolására átalakítottunk koleszta-1,4--dién-3-ont, koleszt-4-én-3-ont, koleszt-5-én-3-on és koleszterint. Valamennyi vegyületből jó termeléssel kaptunk androszta-l,4-dién-3,17-diont. Ezenkívül megállapítottuk, hogy az átalakító mikroorganizmus egyrészt jelentős észteráz-aktivitással rendelkezik, pl. koleszteril-acetátból androszta-l,4-dién-3,17-diont állít elő azonos kinyeréssel, mint koleszterinből. Másrészt telített A-gyűrű esetén is kialakítja az l,4-dién-3,17-diketoszerkezetet. Pl. 5 alfa-kolesztán-3 béta-olból, 5 alfa-kolesztán-3-onból, illetve 5 alfa-pregnán-3,20-dionbói jó termeléssel alakít ki androszta-l,4-dién-3,17-diont. Ugyanezek a folyamatok elvégezhetők a megfelelő 17-ketocsoporttal rendelkező androsztán-vázas vegyületekkel is. így pl. androszt-5-én-3 béta-ol-17-onból és androszt-4-én-3,17-dionból szintén jó termeléssel nyerhetünk androszta-l,4-dién-3,17-diont. Ezeket az alapfolyamatokat más 17 béta-oldalláncú és a vázon módosított egyéb szteroidokra is kiterjesztettük. E célból megvizsgáltuk az ergoszterint, ergoszta-4,22-dién-3-ont, béta-szitoszterint, sztigmaszterint, koleszta-4,6-dién-3-ont, pregn-5-én-3béta-ol-20-ont, pregna-5,16-dién-3-béta-ol-20-on-3-acetátot, progeszteront, 5alfa-pregnán-3,20-diont és androszta-4,6-dién-3,17--diont. Megállapítottuk, hogy az oldallánc lebontásával az l,4-dién-3,17-dion-szerkezet minden esetben kialakul, a koleszta-4,6-dién-3-on és az androszta-4,6-dién-3,17-dion esetén a A6--kettőskötés, ergoszterin esetén a zl7-kettőskötés és a pregna-5,16-dién-3béta-ol-20-on-3-acetát esetén a zíl6-kettőskötés egyidejű telítése mellett. A találmányunkban szereplő mikrobiológiai átalakításokat a Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. kiadás, 1957) szerint Mycobacterium phlei-ként azonosított baktériumtörzzsel végeztük. A baktérium az alkalmazott táptalajban szemmel látható, állásra kiülepedő, apró szemcséket képez. Növesztéséhez nem szükséges feltétlenül emulgeátor anyag (Tween). A baktérium gazdag nitrogénforrást és aránylag kevés cukrot igényel. 37—45 C°-on növesztve a tenyészet a 48. óra körül érte el maximális szárazanyag tartalmát. A következő táptalajokat találtuk igen alkalmasnak a növesztéshez: I. Kukoricalekvár Glukóz Csapvíz 12 ad 20 g 10 g 1000 ml A táptalajt a következőképpen készítettük: Vizes 2,4—4%-os kukoricalekvár oldatot neutralizáltunk és szűrtünk vagy centrifugáltunk. A táptalaj többi alkotórészét (glukóz, hiányzó vízmennyiség) ezután adtuk hozzá. A kukoricalekvár mindenkori százaléka annak minőségétől, illetve nitrogéntartalmától függ. . Kukoricalekvár 12 g Élesztőautolizátum 50 ml Csapvíz ad 1000 ml 10 15 20 Í0 40 45 55 A pH-t 6,8—7-re állítottuk sterilezés előtt. Az élesztő autolizátumot „Mikroorganismen der Gärungsindustrie", (7. Auflage, Hans Karl,. Nürnberg, 1956) 527. oldalának előírása szerint készítettük. III. Kukoricalekvár Glukóz Aszparagin Glutaminsav Csapvíz ad 5 g 10 g 4 g 3 g 1000 ml A pH-t 6,8—7,2-re állítottuk sterilezés előtt. A táptalajokat a 153.173 lajstromszámú magyar szabadalom szerint sterileztük. A lombiktáptalajokat ferde agárról lemosott 1 ml sejtszuszpenzióval, a laborfermentort egy napos rázottlombik tenyészettel oltottuk be. A beoltott lombikokat 37 C°-on körrázógépen két napig rázattuk, percenként kb. 300-as fordulatszámmal, 2 cm-es kitéréssel. Fermentorban 37—45 C°-on 250-es percenkénti fordulatszámmal kevertetve, egy térfogat levegőt táptalajliterenként és percenként a tenyészet felületére fúvatva két nap alatt nyertünk megfelelő tenyészetet. Habgátlót nem alkalmaztunk. A kinőtt tenyészetet azután ülepítettük. Ülepítés után a táptalajt a sejtekről elöntöttük és azonos térfogatú steril vízzel, vagy előnyösebben 0,4%-os nátrium-klorid-oldattal cseréltük ki, tapasztalataink ugyanis azt mutatták, hogy a növesztő táptalaj megmaradt cukortartalma és esetleg más komponensei rontják a baktérium szteroid-átalakító képességét. Ezután az átalakítandó anyagokat és a 8-hidroxi-kinolint alkoholban, acetonban vagy dioxánban oldva adagoltuk a tenyészethez. A szteroid-átalakítás a növesztés körülményei között, de 37 C° körüli hőmérsékleten további két nap alatt történt. A fermentlevet ezután szűrtük vagy centrifugáltuk, mert a keletkezett l,4-dién-3,17-dion a szürletben, illetve a felülúszóban található. A leszűrt sejtek újra képesek átalakításra, új sóoldatban, szteroid- és gátlószeradagolás után. A fermentáció során képződő l,4-dién-3,17--dion-szerkezetű szteroidok mennyiségét az alábbi módon határoztuk meg: a fermentátum mért mennyiségét diklór-etánnal kimerítően kivontuk, majd híg nátronlúggal és ezután vízzel többször mosva 8-hidroxi-kinolinmentesítettük. Vízmentes nátriumszulfáttal szárítottuk és bepároltuk a kivonatot. A bepárolt maradékot acetonban oldottuk és az acetonos oldatot propilénglikollal impregnált papírra cseppentettük, majd szán-tetrak'orid : metil-ciklohexán = 1:1 keverékkel leszálló módszerrel kromatografáltuk. A keletkezett termékek ultraibolyafényben erős elnyelést adnak, ezért a szárított papírt kontakt eljárással lefényképeztük és a fénykép foltjait 60 visszajelöltük a papírra. A megfelelő papírrészt kivágtuk, 10 ml absz. alkohollal leoldottuk és az oldat extinkcióját '•• = 244 m/a-nál mérve állapítottuk meg a keletkezett termék mennyiségét. 65 A termék kinyerése a következőképpen tör-9