153739. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubmerz Claviceps tenyészetek alkaloid termelésének fokozására
153739 6 Az eljárás alkalmazhatóságát mindkét alkaloidcsoport, a peptid, ill. klavinalkaloidok esetében igazoltuk. Jellemző hatást értünk el egy rozs szklerociumból származó, ergotoxint termelő mutans kultúrával (Ix 13—28), egy rozs-szklerociumból származó ergotamint termelő közvetlen törzzsel (T20), Pennisetum typhoideumról származó agro- és elimoklavint termelő törzzsel (B 35) és egy Paspalum distichumról származó, ergometrint és klavinalkaloidot termelő törzszsel (PA-me). A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük: 1. példa: Ergotoxint termelő Ix 13—26 törzs 1 hónapos malátás ferde tenyészetéről a micélium réteget lekaparjuk, steril vízzel szuszpendálva az alábbi összetételű, 100 ml I. jelű táptalajba oltjuk: % ozmózis nyomás szacharóz 10 6,7 atm. borostyánkősav 1 2,05 atm. Ca(N03 ) 2 0,1 0,43 atm. KH2 P0 4 0,025 0,08 atm, MgS04 0,025 0,10 atm. KCl 0,012 0,08 atm. 10 velése süllyesztett (rázott, vagy fermentációs) Claviceps kultúrák táptalajában új, az eddigiek során nern alkalmazott módszer, mely számottevő előnyöket biztosít az üzemi anyarozsalkaloid termelés szempontjából. 1. Termelő törzs és termelésre alkalmas táptalaj esetében a kontroll (adalék nélküli) fermentációhoz képest 5—10-szeres alkaloidértéket kapunk. 2. Alakaloidtermelést kapunk olyan táptalajon is, melyen adalékanyag nélkül alkaloidtermelés a jó növekedés ellenére nem jelentkezik. 3. Alkaloidtermelést érünk el olyan Claviceps 15 törzzsel, mely az alkaloidtermelésre alkalmas táptalajokon adalékanyag nélkül alkaloida termelésre képtelen törzsnek minősült volna. 4. A termelt ossz. alkaloid mennyiségen belül nő az ergometrin aránya elsősorban a klavintípusú alkaloidok rovására. 5. A növekedés jellegének megváltozása miatt a tenyészet hígabb, poliszacharidképző törzseknél a viszkózus sűrűsödés elmarad, a fermentáció jól kevertethető és levegőztethető, habzása lényegesen kisebb. 6. Mindezek alapján gyakorlatilag hasznosítható alkaloidtermelést tudunk elérni az ipari kultúrában olyan törzzsel, mely egyébként számottevő alkaloidtermelésre nem, vagy csak felületi kultúrában volt képes. A tenyésztés 24° C-on, rázóasztalon történik, 7. napon a tenyészet 25 mi-ével leoltunk kétszer 300 ml I. táptalajt. Ezt ismét 24° C-on rázatjuk 6 napig, majd egy-egy tenyészettel 6 literes fermentációt indítunk. A főfermentáció táptalaja fenti összetevőkön kívül az alábbi adalékot tartalmazza: NaCl 2,0%, ozmózisos nyomás 6,4 atm. A párhuzamosan oltott, kontroll fermentáció táptalaja megfelel az I. táptalajnak. A fermentációt kevertetve 0,5 liter/liter térfogat levegővel 24° C-on 8 napig folytatjuk, ekkor a fermentléből az alkaloidot szerves oldószerrel extraháljuk, borkősavas vízbe visszaszorítjuk és az utóbbi alkaloidtartalmát vanUrkreagenssel képzett szín alapján ergotamintartarátra viszonyítva meghatározzuk. A képződő alkaloid fermentlé literenként 680 mg, a kontroll, adalékanyag nélküli fermentációnál 120 mg. 2. példa: Maláta agár tenyészetről fent leírt módon oltunk 100 ml I. táptalajt, melyhez a következő adalékot adjuk: 20 szorbit 5,0%, ozmózisos nyomás 6,6 atm. 4 napos tenyésztés után ennek 10 ml-ével újabb szorbittal kiegészített, 100 ml-es I. táptalajt oltunk. A második tenyésztést 8 napig folytatjuk, 5. napon megismételve steril körülmények között az 5,0% szorbit beadagolását. Leálláskor a tenyészet alkaloidszintje 760 gamma/ml, a hasonló átoltásokkal, I. táptalajon, adalékanyag nélkül fermentált tenyészet alkaloidtermelése 220 gamma/ml. 20 25 a pH-értéket NH4 OH-val 5,2-re állítjuk. 35 40 45 50 55 60 65 3. példa: Pennisetum typhoideiumról származó B 35 jelű törzset burgonyaagar felületéről 100 ml II. táptalajba oltjuk, mely I. táptalajtól abban különbözik, hogy borostyánkősav helyett 1,0% L-aszparagint tartalmaz. 8 napos rázott tenyészetből kétszer 300 ml II. táptalajt oltunk, melyet 24° C-on 5 napig rázatunk. A két tenyészettel 6 liter keverős levegőztetett fermentorokat indítunk. A főfermentáció a II. táptalajban az alábbi adalékot tartalmazza: Ca(N03 ) 2 0,6%), ozmózisos nyomás 2,6 atm. A kontrollfermentációt e nélkül folytatjuk. 8 nap után a fermentléből a micéliumot leszűrjük, a lét kloroform-izopropanollal extraháljuk, az alkaloidot borkősavoldatba visszaszorítjuk ós koncentrációját van Urk reagens hozzáadása után lizergsav standardra vonatkoztatva meghatározzuk. 3
