153665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
I 9 szítménynek injekció céljaira alkalmas állapotnak kell. lennie. Az adrenokortikotrop hatású peptid koncentrációját olymódon kapjuk meg, hogy a készítmény aktivitása pl. 10—50 NE'/ml legyen. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák: szemléltetik. iE példákban a hőmérsékleti adatok Celsius-fokokban értendők. A példákban említett vékonyrétegű kromatográfiai műveletek során; az alábbi oldószerrendszerek kerültek alkalmazásra: „43" rendszerő terc.amilalkdhol — izopropanol — víz i(100:40í55), „52" rendszer: n-butanol — jégecet — víz (100:10:30), „100" rendszer: etilaoetát — piridin — jégecet — víz i(62 21:6:11), „•101" rendszer: n-butanol — piridin — jégecet — víz (30:20:6:2,4). A példákban az alábbi rövidítéseket alkalmaztuk: Z = karbobenzoxi, BOG = terc.butiloxikarbonil, tBu = tere.butil. 1. példa: 1. terc.Butiloxikarbonil-D-szerin^hidrát 10,5 g ,(0,1 mól) D-szerint 50 ml 2 n nátriumhidroxidoldatban oldunk és 15,7 g (0,11 mól) tere.butiloxikarbonilazid 50 ml metanollal készített oldatát adjuk hozzá. Ezután 40° hőmérsékletien, keverés közben, 4 óra alatt hozzácsepegtetjük 11,1 g (0,11 mól) trietiíamin 100 ml metanollal készített oldatát. Az elegyet 40° hőmérsékleten további 2, óra hosszat keverjük, majd éjjelen át szobahőifokon folytatjuk a keverést, azután 2 n sósavval 6—7 pH-értékre állítjuk a reakcióelegyet és 30° hőmérsékleten vákuumban mentesítjük a metanoltól. A visszamaradt vizes oldatot felülrétegezzük etilacetáttal és 0° hőmérsékleten keverés közben tömény sósavval 1—2 pH-értékre savanyítjuk. Az etilacetátos fázist gyorsan elkülönítjük, telített nátriumkloridoldattal többször mossuk, szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A visszamaradt 19,8 g olajszerű termék: kevés vízzel 0° hőmérsékleten eldörzsölve monohidrát alakjában kristályosodik. 15,00 g i(az elméleti hozam 71%~a) 50—52' -on olvadó terméket kapunk. Kevés vízből történő átkristályosítás után az olvadáspont változatlan marad; [a]20D = +9,1 +1° (c = 1,1 vízben). A termék: vékonyrétegű kromatografálás során egységes anyagnak mutatkozik: Rfe = 0,31; Rf100 = 0,6,5. 2. te:rc.Butiloxikárbc<nil-D-szeril-D-metionin-metilószter 2,08 g (9,3 millimól) BOC-D-szerin-hidrátot és 1,52 g(9,3 millimól) metionin-metilésztert 31 10 ml acetonitrilben szobahőfokon oldunk, majd az oldatot jégfürdőben lehűtjük és további 15 ml aoetonitrillel és 5 ml dimetilformamiddal hígítjuk. Ehhez a reakcióelegyhez 2,12 g i(10,2'8 5 millimól) diciklohexilkarbodiimidet adunk 1,5 ml acetonitrilben oldva, majd az elegyet szobahőfookn 1 óra hosszat reagálni hagyjuk. Ezután 0°. ^hőmérsékletre hűtjük le és éjjelen át ezen a hőfokon állni hagyjuk. Utána 0,1 ml 10 jégecetet adunk hozzá, a levált: diciklohexilkarhamidot leszűrjük, a szűrőn maradt anyagot aeetonitrittel utánamossuk és az, oldószert vákuumban '30—35° hőmérsékleten ledesztillálj ük. A kapott olajszerű maradékot 50 ml etilaee-15 tatban felvesszük, a karbamidot mégegyszer kiszűrjük és az etilacetátos: oldatot 0° hőmérsékleten előbb n-sósavoldattal, majd telített nátriumklori doldattal, n-nátriumhidrogénkarbonátoldattal, végül ismét telített nátriumklorid-20 oldattal mossuk. A szerves oldószeres oldat vízmentes magnéziumszulfáton történő szárítása után az oldószert vákuumban, 30—35° hőmérsékleten elpárologtatjuk. A maradékot etilacetát és hexán 25 elegyéből átkristályosítjuk. 2,6 g (az elméleti hozam kb. 80%-a) tercbutiloxikarbanil-DHSzeril-D-metionin-metil észtert kapunk, amely 69—70°-on olvad; [a]D = = +31 +0,5° (c = 2 metanolban). Szilikagélen 30 történő vékonyrétegű kromatografálással, benzol-aceton 1:1 rendszerrel: Rf = 0,5. 3. D-szeril^D-metionin-metilészter-nhidroklorid 35 2,57 g (7,3 millimól) fenti módon kapott dipeptidésztert nedvesség kizárásával oldunk 7,9 ml etilacetátos 4,6 n sósavoldatban. A BOC-csopoírt azonnal lehasad. A reakcióelegyet 90 percig hagyjuk: szobahőmérsékleten állni, majd 40 az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. 2,2 amorf dipeptidészter-hidrokloridot (az, elméleti hozam 100%-a) kapunk. Vékonyrétegű kromatografálással Rfioo — 0,4; Rf43 = 0,45; kloroform-metanol 1:1 arányú rendszerben az 45 Rf-érték = 0,3. 4. tercButiloxikarbonil-D-tirozil-D-szeril-D-metionin-metilészter 50 2,13 g (7,4 millimól) D-szeril-D-metionin-metilészter-hidrokloridot 36 ml acetonitrilben szuszpendálunk és 2,0 g '(7,4 millimól) BOC-D-tirozint adunk, hozzá. Amint a hozzáadott anyag teljesen oldódott, az oldatot —5° hő-55 mérsékletre hűtjük le és, 1,0 ml trietilamint adunk hozzá. Ezután 1,83 g (8,18 millimól). diciklohexilkarbodiimid 19 ml aoetonitrillel készített és ugyancsak lehűtött oldatát adjuk hozzá, majd a reakcióelegyet —5° hőmérsák-60 leteti még egy óra hosszat keverjük. Éjjelen át 0°-on állni, hagyjuk a reakcióelegyet, majd kevés jégecetét adunk hozzá és még 30 percig hagyjuk: 0° hőmérsékleten állni. A diciklohexilkarihamidot kiszűrjük, a szűredéket vákuum-65 ban kis térfogatra pároljuk be, majd 0° hőa
