153247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidet tisztítással egybekötött kinyerésére állati szevkivonatokból

3 153247 4 ioncserélő műgyanta szükséges, amelynek a regenerálása hosszadalmas. Az ismert eljárásokbal sem a hozam, sem a tisztulás nem megfelelő, yizsgálattaiitk szerint a káwikrein^inhibi, tor és Mpszin-kMIbitar hatású poHipeptidek ki^./ 5 nyerésére állati szervfcivonatokból nem alkialmasták a hasonló anyagok tisztításánál általánosan alkalmazott módszerek, így pl. alumíniumoxidon vagy fcallriuimfoszíát-gélen végzett adszorbeáltiartás sem. Ezek az adszorbensek nagy mennyiségű 10 ballaszt-anyagot is megkötnielk, így a tisztulás nem megfelélő, az eljárás nagy mennyiségű adszorbenst ós leoldószert igényel és a hozam sem megfelelő. A találmány .célja olyan eljárás biztosítása, 15 amely kiküszöböli az ismert eljárások hátrárnyait és lehetővé teszi a kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipepitidék jó hozammal és megf elélő tisztaságban való kinyerésiét állati szervkivonatakból, ipari méretben is 20. könnyen megvalósítható módszerrel. A tlalátoány azon a felismerésen alapszik, hogy a kallikrein-inhibiítor és tripszin-inhibitor hatású polipeptldefc sziervkivonatokból pH 5—7 * között szilikát-típusú adszorbenseken specifiiku- 25 san megkötődnek és azokról pH 3 alatt vízzel hígított poláris szerves oldószerrel leoldhatok. Ez a felismerésünk azért meglepő, mert a hasonló típusú adszorbensek a fehérjéket és polipeptideket éppen ellenkezőleg pH 3 alatt kötik 30 meg, és az adszorbeált fehérjék és polipeptidek 8 feletti pH-n oldhatók le vizes vagy szerves oldószeres közegben. A találmány eljárás kallikirein-inhiibitor és tripszin-inlhibitor hatású polipeptidek tisztítás- 35 sal egybekötött kinyerésiére állati szíervkivonartoklból; amely abban áll, hogy a szervkivonatból az aktív poliipeptidekieit szilikát-típusú, adszorbansien pH 5—7 között megkötjük, majd az adszoíbenst elkülönítjük és savas vízzel mos- 40 suk a szennyezések egy részének eltávolításía céljaiból. Ezután az aktív palipap ti deket ásványi vagy erős szerves savval pH 3 alá savanyított, vízzel hígított poláris szerves oldószerrel leoldjuk. Az így nyert savanyú eluátumot ismert __ 45 módon tovább tisztítjuk, például olyan módon, hogy semlegesítve a ballasztanyagok egy részét kicsapjuk, majd az oldatban maradit kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidefeet frakcionált oldószeres kicsapásnak. Vagy 50 az oldószer eltávolítása után frakcionált sós ki'csíapásnak Vetjük alá, illetve fehérje kicsapósZereikfcel-kezeljük. Szilikát-típusú adszorbensiként savval kezelt bentonitot vagy szintetikus zeoiitat célszerű 55 használni. Az aktív palipeptidéket az adszorbensről célszerűen pH 3 alá savanyított, vízzel 30—90%osra hígított alacsony szénatomszámú alkohollal vagy ketonnal oldhatjuk le.. 60 Ha az eluálószert kénsavval, foszforsawal vagy oxálsawal savanyítjuk meg, előnyös a semlegesítést olyan fém oxidjával vagy hidroxidjával Végezni, amely a leoldashoz használt savval szobahőmérsékleten rosszul oldódó sót 55 képez. Ebben az esetben a .semlegesítés után kapott polipaptid-tarta'lmú oldat gyakorlatilaíg sómienites, ami a végső tisztítási lépés szempontjából igen kledvező. A találmány szerinti eljárás számos előnye közül megemlítjük, hogy az alkalmazott szilifcát•Jtípusú adszorbens a megadott körülmények között szelektíven köti meg az inhiibiitor hatású polipeiptidéket, így kis mennyiségű adszorbens szükségesi, a bállasztanyagoík nagy részbe, legalább 80%-« az anyalúgban marad. Az adszorbens mosását és leoldását a megadott körülmé1

nyek között végezve, az aktív anyag jó hozaimmial, az eredeti térfogát 1/10—1/20 részének megfelelő térfogatban nyerhető. Az eljárás kedvező feltételeket biztosít a tovább tisztításként alkalmazott oldószeres kiesapás szamára, minthogy az akitív viszonylag sok oldószert, tehát kevés vizet tartalmazó oldlatlban van és így a kicsapásához szükséges további oldószer menynyisége csekély. Eljárásunkkal átlagban 20—40-szares tisztulás érhető el. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az .alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A kallikrein-inhiibitor aktivitást (KIE) Weirle—• Kaufmann—Boetsch szerint [Hoppe—Seyler's Z. f. physiol, Chem. 319, 52 (I960)], a tripszin-inihibitar aktivitást (TIE) pedig Anson szerint [J. Gen. Physiol, 22, 79 (1939)] mértük. 1. példa: 100 kg darált marhatüdőt 300 liter 1%-os vizes oxálsav-oldattal kievertétünk 2 órán át, majd állandó keverés közben OaO—víz 1 :10 arányban készült szuszpenziójával az elegy pH-ját 6,0-ra állítjuk be. Ezután a iszarvmaradékot dobcenitrifugán elkülönítjük. A kapott oldat aktivitása 650 TIE és 170 000 000 KIE. A kapott oldaithoz 3 kg nagytétényi derítőföldet adunk és 2 órán át fcevertetjük, míajd 3 órán át ülepedni hagyjuk. A leülepedett adszorbensről a felülúszó naigy részét leszívatjuk. Az adszorbenst ülepítő centrifugában elkülönítjük, 10 liter vízzel felszuszpendálva átmossuk és ismlét centrifugáljuk. Ezután az adszorbenst 0,2m, Hd-<t tartalmazó 70%-os acetonnial .kevertetjük, először 10, majd 5 literrel, 1—1 órán át. Az eluátumot szűréssel elkülönítjük. Az öisiszegyujtött aoétonos sósavas oldat pH-ját 40%-os NaO H-val 7-re állítjuk be, a kivált csapadékot szűrjük, majd 12 liter aceton hozzáadásával a víz—aceton arányt 1 : önre állítjuk be. A csapadékos oldatot másnapig 5 C°-on állni hagyjuk, majd a kalllikrfein-inihibiitor és tripszin-inhiibitor hatású polipeptidlet tartalmazó csapadékot szűréssel eltávolítjuk, levegő átszívatásával aoetonmentesítjülk és Végül 2 liter vízben feloldjuk. Az így kapott oldat aktivitása összesen 350 TIE (a szervkivonatiban levő aktivitás 54%-a) és 89 000-000 KIE, tisztasága 2,5 TIE/g fehérje. 2. példa: 10 kg rriarhatüdőből 60%-os vizes etanollal készült 20 liter kivonathoz 400 g savval kezelt