153173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1,4-androsztadién-3,17-dion mikrobiológiai előállítására

153173 részről technológiai előnyt is jelent: a zJ4-3--keto szteroidok könnyen kimutathatók, és így kvantitatíve meghatározhatók Q- : 242 rmi-nál éles elnyelési maximumot adnak), míg a A5-3-ß-oxi-vegyületck csak általános, szterin-reagen- 5 sekkel indikálhatok, és ezeknek az anyagoknak a spektrofotometriás meghatározása sem lehetséges, mert elnyelési maximumot ?~ : 215 m^-nál adnak, az alacsony hullámhossz pedig nem teszi lehetővé rutinanalízist. 10 A találmány eljárás l,4-androsztadién-3,17--dion mikrobiológiai előállítására, amely abban « áll, hogy félszintetikus táptalajon tenyésztett Mycobacterium smegmatis törzs (letétbe helyezve 27. sz. alatt 1965. márc. 5 n. az Országos 15 Közegészségügyi Intézet törzsgyűjteményében) sejtjeivel aerob fermentációs körülmények mellett ,4-kolesztén-S-ont kinolin-származékok, célszerűen 8-oxikinolin jelenlétében lebontunk. Régebben kimutattuk, hogy különböző ki- 20 Sebb, 2—3 gyűrűt tartalmazó vegyületek megakadályozzák a szteránváz mikrobiológiai le^bontását [148 093 sz. magyar szabadalom (1959 aug. 12.)]. Jelen esetben a vizsgált különféle gyűrűrendszerek közül legalkalmasabbnak a 8- 25 -oxikinolin mutatkozott. Hasonló értelemben alkalmazhatók azonban egyéb kinolin-származékok is, pl.: 3-metil~8-oxikinolin, 7-metil-8-oxikinoliri, 8-oxikinolin-7-kiarbonsav, 5^aceto-8--oxikinolin, 5-butiro-8-oxikinolin, 5-izovalero- 30 -8-oxikinolin, 5-klór-7-jód-8-oxikinolin (vioform), 8-oxikinolin-Echtblau-azovegyület stb. Az átfelakítás jó kivitelezhetősége szempontjából nem 'közömbös az sem, hogy különválasztottuk a növesztési fázist az átalakítási perió- 35 dústól. Ha a sejtek a kifermentált táptalajban maradnak, akkor a gátló, kisebb gyűrűrendszer jelenlétében is különféle oxidációs termékek szaporodnak fel, és így az 1,4-androsztadién-3,17-dion koncentrációja nem éri el a szükséges 40 magas értéket. A sejteket steril vízben szuszpendálva •& növesztési periódus után a mellékreakciók visszaszorulnak, és kevés 4-^androsztén- ! -3,17-dion mellett viszonylag magas koncentrációban megjelenik az l,4-androsztadién-3,17- 45 -dión. Víz helyett azonban még előnyösebb 0,4.—0,9%ros NaCl oldat alkalmazása szuszpendáló ágensként. Az átalakítás hatékonyságát erősen növeli, ha a növesztő táptalaj Tween 80, 81, 85 stb. 50 oldatot tartalmaz, célszerűen 0,1—0,2% meny-' nyiségben. Az így növesztett tenyészet gyorsabban metabolizálja a 4-kolesztén-3-ont, és így nő a hasznos termék mennyisége.. A 4-kolesztén-3-ont 20—100 mg/100 ml koncentrációban cél- 55 szerű alkalmazni. Eljárásunk ipari alkalmazhatóságának lehetőségét előnyösen növeli az a körülmény, hogy egyszer már átalakításra használt tenyészetet az l,4-androsztadién-3,17-dion tartalmú fermenüétől. elválasztva, azt friss. só- 60 oldatban szuszpendálva, újból alkalmazhatjuk 4-kolesztén-3-on lebontására. Mint fjentebb már említettük, valamilyen Tween-féleség jelenléte a növesztési fázisban előnyös az átalakítás szempontjából. A Tween- g5 tartalmú vizes oldaton levegőt átfúvatva, az erősen habzik. Megállapítottuk, hogy a fermentoros tenyésztés szempontjából előnyös, ha 300— 400 percenkénti fordulatszámmal kevertetett tenyészet felületére táptalajliterenkánt és percenként 0,2—1,0 térf. levegőt fúvatunk, mert így elégséges oxigént szolgáltatunk a M. smegmatis növekedéséhez. A növesztő táptalaj _összetétele is lényeges az ipari fertnentációnál. Igen előnyösnek találtuk az organizmus tenyésztésére a következő táptalajokat: I. jelű: 5 g kukoricalekvár, 10 g glükóz, - '. 4 g aszparagin, ( 2 g glutarninsav, csapvízzel feltöltve 1 literre; a pH-t 6,8—7,2-re állítottuk sterilezés előtt. II. jelű: 5 g kukoricalekvár, 0,4 g karbamid, 20 g glükóz, csapvízzel feltöltve 1 literre; a pH-t 6,8—7,2-re állítottuk sterilezés előtt. III. jelű: 20 g kukoricalekvár, 20 g glükóz, csapvízzol feltöltve 1 literre; a pH-t 6,8—7,2-re állítottuk sterilizes előtt. A táptalajokat 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba szétosztva, 121 C°-on 20 percig sterilizáltuk auteklávhan, vagy 5 liter táptalajt tet'tünk ip literes üvegfermentoirba, és 121 C°-on 45 percig sterilizáltuk. A beoltott lombikokat 28 C°-on vagy 37 C°-on rázógépen 2—3 napig inkubáltuk. Az inkubálás alatt a lombikok 2 cm kitérésű körpályán percenként kb. 300-as fordulatszámmal rázódtak. Fermentorban azonos hőmérsékleten 300—400-as fordulatszámmal inkubáltuk a tenyészeteket, és táptalajliterenként és percenként 0,2—1,0 tf. levegőt fúvattunk a tenyészet felületére. "Az átalakítandó 4-kolesztén-3-ont alkoholban oldva adagoltuk a tenyészethez. A beadagolt, ill. keletkezett szteroid mennyiségét 2X0,25 tf. diklóretánnal extraháltuk, majd az extraktumot 0,08 tf.-ra bepároltuk. Ebből a konoentrátumból 100 /J-t futtattunk, előzőleg 18% karbitolt tartalmazó metanollal impregnált, Macherey—Nagel 214-es papíron, karbitollal telített normál heptánnal, -leszálló technikával. A papírkrornatogramon a foltokat kontakt uv. fényképezéssel, ill. Zimmermann reagenssel hívtuk elő és így kvantitatíve meghatároztuk. A folt kimutatása után a megfelelő papírrészt kivágtuk, 10 ml. p. a. absz. alkohollal eluáltuk, és az eluátum extinkcióját mértük ">• : 242 m^-nál. A kapott értéket stan-2 .