152502. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomiciéták antibiotikumtermelőképességének fokozására
3 152502 4 Az alkalmazott törzs spóráit szintetikus folyékony táptalajban szubmerz módon tenyésztjük mintegy 6—14 órán át, majd a csírázásnak indult spórák szuszpenzióját oltjuk a fentiek értelmében előkészített nitrofuránszármazékkal kezelt táptalajra. A beoltott táptalajt előnyösen 28 C° körüli hőmérsékleten 12—20 napig inkubáljuk, majd a kifejlődött telepeket a szokásos módon átizoláljuk szilárd spóráztató táptalajra. Az ily módon nyert törzsek antibiotikus aktivitása rázott tenyésztési körülmények között vizsgálandó. Fenti módszerrel Streptomyces aureofaciens és Streptomyces rimosus auxotrofokat használva teszt-mikroorganizmusként, és a mutációs frekvenciát a kiindulási spóraszámra vonatkoztatott visszamutálások számából megállapítva (Appl. Microbiol, 6, 45, 1958), az alábbi eredményeket kaptuk: 10 Spontán I. II. III. vissza-2,5 4,5 7,5 2,5 4,5 7,5 2,5 4,5 7,5 mutálás ,- y/ml y/ml y/ml .10-6 •10-« •10-6 •10-6 S. aureofaciens N—4 met 1~~ 0,28 6,2 5,5 3,2 5,5 4,5 3,2 3,5 1,0 0,5 S. aureofaciens N—9 met 3~ 0,041 4,2 3,0 2,5 3,0 2,8 1,5 1,5 0,5 0,1 S. aureofaciens N—11 met 2~ am2_ 0,083 0,3 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 S. rimosus N—41 am 1~ 0,062 4,8 3,1 2,2 2,6 2,0 1,1 0,5 0,5 0,1 I. = l-(5-nitro-furfurilidén-amino)-2-imidazolidin-tion II. = 5-nitro-2-furaldehid-szemikarbazon III. = N-(5-nitro~2-furfurilidén)-l-aminohidantoin A fenti táblázat szemléltetően mutatja a vegyületeknek különféle streptomicétákra gyakorolt mutagen hatását. Eljárásunk segítségével megállapításunk szerint olyan mutánsok nyerhetők, amelyek antibiotikumtermelése fokozott. 35 Így előnyösen alkalmazható Streptomyces aureofaciens, S. rimosus, S. antibioticus, S. erythreus, S. fradiae, S. fradiae, S. griseus, S. hygroscopicus, S. noursei, S. niveus stix, törssetape-és,,,.., egyéb streptomicétákra, amelyek antibiotikumot 40 termelnek. . .,.*-" Eljárásunk részletei a példákban találhatók, amelyekben néhány törzsön az antibiotikum termelésnek a mutagen behatás következtében beálló fokozódását is bemutatjuk. 45 Példák: 1. 3500 E/ml antibiotikus aktivitású Streptomyces aureofaciens C—81305 törzs spóráit (spó- 50 raszám a táptalajra nézve 106 /ml) 28 C°-on 8 órán át rázóasztalon inkubáljuk percenként 320 rázatással. Az alkalmazott táptalaj a következő: szaharóz: 2,5%, KH2 P0 4 0,1%, (NH^SOÍ 0,3%, CaC03 0,3%, pH: 7,0. (100 ml táptalaj, 500 ml 55 Erlenmeyer lombikban). 8 órás inkubáció után a csírázásnak indult spóraszuszpenziót a mutagen ágenseket tartalmazó táptalajra szélesztjük, 100-szoros hígítással, majd 28 C°-on 16 napig inkubáljuk. A szilárd táptalaj összetétele: (ned- 60 ves) kukorioalekvár 0,65%, szaharóz 1,0%, KH2P0 4 0,4%, (NH 4 ) 2 S0 4 0,2%, MgS0 4 0,5%, agar 2,0%, pH: 6,6. Ehhez a táptalajhoz 60 C°-on, steril körülmények között annyi l-(5--nitro-furfurilidén-amino)-2-imidazolidin-tion-6- 65 ot adunk dimetilformamidban oldva, hogy koncentrációjuk a táptalajra vonatkoztatva 2,5 y/ml, illetve 0,05% legyen. A 16 napos inkubáció után keletkezett spórás tenyészetből fenti összetételű szilárd táptalajra történő átoltással nyerjük az A—801500 jelzésű törzset, melynek antibiotikus aktivitását pl. a következő rázott tenyésztési , módszerrel állapítjuk meg: "A szilárd táptalajon kifejlődött spórás tenyészetéből oltunk 50 ml steril előinokulum táptalajt (500 ml-es Erlenmeyer lombikban), a következő összetétellel: kukoricalekvár (nedves) 2,0%, szaharóz 2,0%, CaC03 0,2%, (NH 4 ) 2 S0 4 0,1% KH2 P0 4 0,5%, MgS0 4 0,250/o, pH: 6,5. A tenyészetet 28 C°-on 24 órán át inkubáljuk rázóasztalon (320 rázatás percenként), majd a kifejlődött tenyészet 5 ml-ét átoltjuk 50 ml steril inokulum táptalajba (500 ml-es Erlenmeyer lombikban), melynek összetétele a következő: kukoricalekvár (nedves): 1,6%, szaharóz 3,0%, (NH4 ) 2 S0 4 0,7%, CaCO 0,5%, pálmaolaj 0,5%, pH: 6,5. 24 órai, 28 C°-on, rázóasztalon való tenyésztés után a kifejlődött tenyészet 5 ml-ét átoltjuk 50 ml steril fermentációs táptalajba (500 ml-es Erlenmeyer lombikban). A fermentációs táptalaj összetétele: kukoricalekvár (nedves) 2,5%, (NH4 ) 2 S0 4 0,8%, keményítő 6,0%, mogyoróliszt 1,5%, CaC03 0,9%, MaS0 4 0,0014%, pálmaolaj 0,5%, pH: 6,5. A beoltott táptalajt 28 C°-on, rázóasztalon inkubáljuk, 96 óra után meghatározzuk a fermentlé tetraciklin tartalmát. A töfes aktivitását 4800 E/ml-nek találtuk. A Strepj»myces aureofaciens A—801500 törzs spóráit (spóraszám a táptalajra nézve 106 /ml) 2
