151985. lajstromszámú szabadalom • Eljárás demetiltetraciklinek előállítására új Streptomyces törzzsel
151985 ként alacsony össztetraciklin termelés lép fel. (J. Goodman és mtsa: J., Bacteriol. 82, 615, 1961.). Azt találtuk, hogy tetraciklmek demetil-analógjainak demetiltetraciklineket termelő Streptomyces aureofaciens törzsekkel való előállításánál előnyös a metilezési inhibitorokat fokozatosan adagolni a táptalajhoz. Eljárásunk előnyös foganatosítási módja szerint oly módon járhatunk el, hogy az I. képletű inhibitorokat (ahol R jelentése szerves gyök) a fermentáció első 24 órájában 3 óránként adagoljuk úgy, hogy a fermentáció során képződött protein és nukleinsavak mennyiségének a beadagolt inhibitor mennyicégének s a beadagolt inhibitor mennyiségének aránya állandó legyen. I. képletű szulfonamidként alkalmazhatunk p-aminobenzolszulfonilguanidint előnyösen 400— 4000 y/ml, és/vagy 2-(p-amino-benzolszulfonil)-4-metil-tiazolt előnyösen — 50—500 y/ml és/vagy 2-p-amino-benzolszulfonil-4,6-dimetil-pirimidint előnyösen 100—1000 y/ml és/vagy 2-(p-amino-benzolszulfonil)-6-metoxi-piridazint 100—1000 y/ml mennyiségben. A metilezést gátló vegyületek fokozatos adagolásával lényegesen magasabb össz-tetraciklin termelés és ezen belül magasabb demetilanalóg-termelés érhető el. A demetil tetraciklmek fermentléből való kinyerése az irodalomból ismert módszerekkel történik (2.878.289 és 3.050.558 sz. USA, valamint 221.714 sz. osztrák szabadalom). Eljárásunk előnye, hogy az általunk előállított új Streptomyces aureofaciens CDM—2114 jelű törzs, amelyet az Országos Közegészségügyi Intézetnél (Budapest) 631.008/25. sz. alatt he-lyeztünk letétbe és e törzs utódai 4000 E/mí össz-tetraciklin termelés mellett 70—80% 6-demetiltetraciklin-analógot termelnek, míg más, ismert Streptomyces aureofaciens törzsek esetében a 6-demetiltetraciklin analóg aránya lényegesen alacsonyabb. Eljárásunk részletei a példákban találhatók, megjegyzendő azonban, hogy e találmány köre nincsen ezekre a példákra korlátozva; tehát a találmány kiterjed mindazon Streptomyces rekombinánsokra, melyeket valamely, a (^-anyagcserével összefüggő deficiens biokémiai mutánsokból állítanak elő, illetve ezek utódaira, variánsaira, mutánsaira. Példák: 1. Az N—4 metionin, valamint az N—6 arginin-cisztein deficiens biokémiai mutáns szilárd spóráztató táptalajon kifejlődött tenyészetéről nyert, desztillált vizes spóraszuszpenzióból 2—2 ml-re (2-107 spóra) oltunk olyan „minimális" szilárd spóráztató táptalajt, melyhez előzetesen ÍO^1 M 1-metionint, 10~8 M 1-arginint és 5 • 10-6 M 1-ciszteint adagoltunk, továbbá ametopterint 100 y/ml mennyiségben. 27 C°-on való 14 napos inkubáció után a keletkezett prototróf rekombinánsokat átoltjuk szilárd spóráztató táptalajra, mely ugyancsak tartalmaz ametopterint 150 y/ml és p-amino-benzolszulfonilguanidint 500 y/ml mennyiségben. A „minimális" szilárd spóráztató táptalaj összetétele: szaharóz 15,0 g, Ca(N03 ) 2 3,5 g, K 2 HP0 4 1,0 g, MgSCV 5 -7H2 0 0,5 g, NaCl 1,0 g, FeS0 4 -7H 2 0 0,05 g, desztillált víz 1000 ml, agar 20,0 g, pH = 6,8. A szilárd spóráztató táptalaj összetétele: szaharóz 15,0 g, Ca(N03) 2 3,0 g, (NH 4 ) 2 HP0 4 1,0 g, K2 HP0 4 1,0 g, MgS0 4 -7H 2 0 0,5 g, NaCl 1,0 g, 10 FeS04 -7H 2 0 0,05 g, 1-aszparagin 1,0 g, desztillált víz 1000 ml, agar 20,0 g; pH = 6,8. 16—20 napos inkubáció után fermentációs módszerekkel megvizsgáltuk az előállított 25 rekombináns demetilklórtetraciklin termelését; a 15 közülük kiválasztott DM—14 jelű rekombináns demetilklórtetracikiin-termelése 45%. 2. Az N—11 metionin-aminonitrogén, valamint az N—18 cisztein-aszparagin deficiens biokémiai mutáns szilárd spóráztató táptalajon ki-20 fejlődött tenyészetéről nyert, desztillált vizes spóraszuszpenzióból 1—1 ml-re (10 spóra) oltunk olyan, az 1. példa szerinti „minimális" szilárd spóráztató táptalajt, melyhez előzetesen 5-10~7 M 1-metionint, 10~* M NH4 Cl-t, 10" 7 25 M 1-ciszteint, 5-10-8 M 1-aszparagint, adagoltunk, továbbá 100 y/ml mennyiségben aminopterint. 14 napos inkubálás után a keletkezett prototróf rekombinánsokat átoltjuk az 1. példában leírt szilárd spóráztató táptalajra, mely 30 ugyancsak tartalmaz aminopterint 150 y/ml, továbbá 2-(p-amino-benzolszulfonil)-4-metil-tiazolt 50 y/ml mennyiségben. 16—20 napos inkubáció után megvizsgáltuk az előállított 36 rekombináns demetilklórtetra-35 ciklin-termelését; a közülük kiválasztott DM—41 jelű rekombináns 40—45%, demetilklórtetraciklint termel. 3. Az N—16 metionin-aszparagin, valamint az N—6 arginin-cisztein deficiens biokémiai mu-40 táns szilárd spór áztató táptalajon kifejlődött tenyészetéről nyert, desztillált vizes spóraszuszpenzióból 1—1 ml-rel (10~8 spóra) oltunk olyan, az 1. példában leírt „minimális" szilárd spóráztató táptalajt, melyhez előzetesen 10~6 M 1-45 -metionint, 10~7 M 1-aszparagint, 10~ 8 M 1-arginint és 5 • 10-6 M 1-ciszteint adagoltunk, továbbá 100 y/ml aminopterint és 150 y/ml 2-(p-amino-benzolszulfonil)-4,6-dimetilpirimidint. 14 napos inkubáció után a kapott prototróf rekom-50 binánsokat'átoltjuk az 1. példa szerinti szilárd spóráztató táptalajra, mely 150 y/ml ametopterint és 100 y/ml 2-(p-aminobenzolszulfonil)-6--metoxi-piridint tartalmaz. 16—20 napos inkubáció után a 6—12 példák-55 ban ismertetett fermentációs módszerekkel megvizsgáltuk az előállított 42 rekombináns demetilklórtetraciklin termelését, közülük például a DM—16 jelű 30% demetilklórtetraciklint termel. 60 4. A DM—16 törzs desztillált vizes spóraszuszpenzióját — mely 104 /ml spórát tartalmaz — ismert módon ultraibolya fénnyel besugározzuk 3500 erg/mm2 dózisban, a túlélőket az 1. példa szerinti szilárd spóráztató táptalajon, 65 mely 500 y/ml p-amino-benzolszulfonilguanidint 3
